【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗体，尤其涉及一种抗人hmga2蛋白ser105位点磷酸化抗体及其应用。
技术介绍
1、高迁移率族蛋白2(hmga2)与其他dna结构蛋白类似，hmga2在胚胎发生期间在胚胎干细胞中高度表达，但在发育后期和成年期则表达被抑制。hmga2在几乎所有人类恶性肿瘤中重新表达，并通过多种机制促进肿瘤发生。hmga2通过促进细胞周期进入和抑制细胞凋亡来增加癌细胞增殖。此外，hmga2通过激活mapk/erk、tgfβ/smad、pi3k/akt/mtor、nfkb和stat3通路信号传导，影响dna修复机制并促进上皮间质转化。此外，hmga2支持癌症干细胞表型并使癌细胞对化疗药物产生耐药性。总体而言，hmga2可用作癌症预后标志物，尤其是在疾病的侵袭阶段。此外，hmga2可能是潜在的癌症治疗靶点。通过小干扰rna(sirna)或包括二甲双胍在内的特异性抑制剂靶向hmga2可以减少癌症的发展、转移和耐药性。
2、hmga2被认为部分通过调节一系列靶基因来促进肿瘤发生。例如，hmga2刺激人端粒酶逆转录酶(htert)表达，防止癌细胞端粒逐渐缩短。此外，hmga2直接激活促转移基因的转录，包括snail、slug和cxcr4。并且，多项研究表明hmga2的翻译后修饰会影响其生物学功能。例如，酸性c末端尾部的hmga2磷酸化可能会影响其dna结合特性，而hmga2的sumo化修饰可能会促进早幼粒细胞白血病(pml)蛋白降解。有研究显示，hmga2的c端在磷酸化的情况下表现出更为紧凑的结构，这也使得其与靶dna的结合能力
3、缺乏相对应的hmga2磷酸化抗体将导致无法对细胞及组织层面hmga2的磷酸化水平进行定量，也无法为临床肿瘤疾病的诊断或治疗提供潜在的作用靶点。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种抗人hmga2蛋白ser105位点磷酸化抗体及其应用。
2、本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：本专利技术实施例第一方面提供了一种抗人hmga2蛋白ser105位点磷酸化抗体，通过如下步骤制备获得：
3、(1)确定抗人hmga2 ser105蛋白磷酸化位点；
4、(2)根据hmga2靶点序列和所述步骤(1)确定的抗人hmga2 ser105蛋白磷酸化位点设计待合成的磷酸化多肽序列和非磷酸化多肽序列；
5、(3)依据所述步骤(2)中的磷酸化多肽序列和非磷酸化多肽序列合成对应的多肽，并将该多肽与载体蛋白偶联以获取抗原合成肽用作抗原；
6、(4)使用所述步骤(3)获取的抗原合成肽免疫动物并收集抗血清；
7、(5)对所述步骤(4)收集的抗血清进行纯化和鉴定，得到抗人hmga2蛋白ser105位点磷酸化抗体。
8、进一步地，所述确定抗人hmga2 ser105蛋白磷酸化位点，具体包括：
9、通过生物信息学软件筛选hmga2的c端中的潜在磷酸化位点；其中，所述潜在磷酸化位点包括t97、t100、s101、s102和s105位点；
10、构建hmga2位点突变质粒，具体是将潜在磷酸化位点替换成不能被磷酸化修饰的丙氨酸，并进行二代测序验证潜在磷酸化位点氨基酸序列替换为丙氨酸即视为构建成功；
11、293t细胞中转染hmga2野生型质粒或者上述构建成功的位点突变质粒，48h后收集细胞沉淀并通过免疫共沉淀实验检测hmga2上的磷酸化修饰水平，以确定抗人hmga2ser105蛋白磷酸化位点。
12、进一步地，所述磷酸化多肽序列为cteetssqes(pi)aeed，所述非磷酸化多肽序列为cteetssqesaeed。
13、4、根据权利要求1所述的抗人hmga2蛋白ser105位点磷酸化抗体，其特征在于，所述依据所述步骤(2)中的磷酸化多肽序列和非磷酸化多肽序列合成对应的多肽，具体包括：
14、采用固相合成法依据所述步骤(2)中的磷酸化多肽序列和非磷酸化多肽序列合成对应的多肽，并通过高效液相色谱方法对该其进行纯化，直至其纯度大于95％。
15、进一步地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白。
16、进一步地，所述对所述步骤(4)收集的抗血清进行纯化和鉴定，具体包括：
17、采用高效液相色谱方法对所述步骤(4)收集的抗血清进行纯化；
18、采用酶联免疫吸附法对纯化后的抗血清进行鉴定。
19、进一步地，所述采用酶联免疫吸附法对纯化后的抗血清进行鉴定，其流程具体包括：
20、(5.1)包板：用包被缓冲液将步骤(3)获取的抗原合成肽稀释至1μg/ml，再在每个聚苯乙烯板的反应孔中加入50μl稀释后的抗原合成肽，其中包被缓冲液为na2co3和nahco3缓冲液；将聚苯乙烯板置于4℃过夜，次日，弃去反应孔内溶液，再用1xpbst洗涤缓冲液以每孔180μl洗1次；
21、(5.2)封闭：在每个反应孔中加150μl的1％ bsa进行封闭，置于37℃孵育1小时，之后弃去封闭液；
22、(5.3)加样：将纯化后的抗血清使用1％ bsa进行梯度稀释，再各取50μl于上述已封闭的反应孔；同时设置好阴性对照孔；置于37℃孵育1小时，之后弃去封闭液，再用1xpbst洗涤缓冲液以每孔150μl洗3次；
23、(5.4)加酶标抗体：将辣根过氧化物酶偶联二抗得到二抗-hpr，再按照1:5000的稀释比例使用1％bsa进行稀释；然后为每个反应孔中加入50μl稀释后的二抗-hpr，置于37℃孵育45min，之后弃去封闭液，再用1xpbst洗涤缓冲液以每孔150μl洗3次；
24、(5.5)加底物液显色：于各反应孔中加入50μl的3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物溶液，置于37℃反应5min；
25、(5.6)终止反应：于各反应孔中加入浓度为1m的硫酸50μl；
26、(5.7)读板：将聚苯乙烯板置于预热过的酶标仪中进行读数，保存数据，并进行分析；其中酶标仪的激发波长为450nm。
27、本专利技术实施例第二方面提供了一种如上述的抗人hmga2蛋白ser105位点磷酸化抗体的应用，所述抗人hmga2蛋白ser105位点磷酸化抗体在制备诊断或治疗肿瘤疾病药物中的应用。
28、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
29、(1)本专利技术发现抗人hmga2蛋白ser105位点发生磷酸化，本专利技术的磷酸化抗体在实际应用中能够检测抗人hmga2蛋白的翻译后磷酸化修饰情况；
30、(2)本专利技术的磷酸化抗体在实际应用中便于探讨抗人hmga2蛋白特定位点磷酸化修饰与特定生物学事件如细胞命运、增殖与分化、器官发育、组织稳态等的相关性；
31、(3)本专利技术的磷酸化抗体有助于探讨hmga2蛋白的磷酸化修饰在肿瘤疾病发生发展本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗人HMGA2蛋白Ser105位点磷酸化抗体，其特征在于，通过如下步骤制备获得：
2.根据权利要求1所述的抗人HMGA2蛋白Ser105位点磷酸化抗体，其特征在于，所述确定抗人HMGA2 Ser105蛋白磷酸化位点，具体包括：
3.根据权利要求1所述的抗人HMGA2蛋白Ser105位点磷酸化抗体，其特征在于，所述磷酸化多肽序列为CTEETSSQES(pi)AEED，所述非磷酸化多肽序列为CTEETSSQESAEED。
4.根据权利要求1所述的抗人HMGA2蛋白Ser105位点磷酸化抗体，其特征在于，所述依据所述步骤(2)中的磷酸化多肽序列和非磷酸化多肽序列合成对应的多肽，具体包括：
5.根据权利要求1所述的抗人HMGA2蛋白Ser105位点磷酸化抗体，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白。
6.根据权利要求1所述的抗人HMGA2蛋白Ser105位点磷酸化抗体，其特征在于，所述对所述步骤(4)收集的抗血清进行纯化和鉴定，具体包括：
7.根据权利要求6所述的抗人HMGA2蛋白Ser105位点磷酸化抗体，
8.一种如权利要求1-7中任一项所述的抗人HMGA2蛋白Ser105位点磷酸化抗体的应用，其特征在于，所述抗人HMGA2蛋白Ser105位点磷酸化抗体在制备诊断或治疗肿瘤疾病药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种抗人hmga2蛋白ser105位点磷酸化抗体，其特征在于，通过如下步骤制备获得：
2.根据权利要求1所述的抗人hmga2蛋白ser105位点磷酸化抗体，其特征在于，所述确定抗人hmga2 ser105蛋白磷酸化位点，具体包括：
3.根据权利要求1所述的抗人hmga2蛋白ser105位点磷酸化抗体，其特征在于，所述磷酸化多肽序列为cteetssqes(pi)aeed，所述非磷酸化多肽序列为cteetssqesaeed。
4.根据权利要求1所述的抗人hmga2蛋白ser105位点磷酸化抗体，其特征在于，所述依据所述步骤(2)中的磷酸化多肽序列和非磷酸化多肽序列合成对应的多肽，具体包括：
【专利技术属性】
技术研发人员：顾凌凯，吕卫国，沈璋瑾，陈晓静，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属妇产科医院浙江省妇女医院，浙江省妇女保健院，
类型：发明
国别省市：
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