【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用糖基转移酶ugt94e13突变体高效生物合成莱鲍迪苷m8的方法，属于生物催化合成领域。
技术介绍
1、由于高热量糖类的过量摄入导致世界范围内严重的过度肥胖、糖尿病、高血压和心脑血管等疾病。因此，来自甜叶菊的甜菊糖苷类化合物因其甜度高、热量低且安全性高而受到广泛关注。其中，含量较为丰富的甜菊糖、莱鲍迪苷a和莱鲍迪苷d(reb d)等作为甜味剂已广泛应用于饮料、食品等领域。它们具有相较于蔗糖200-300倍的甜度，但是口感上存在甜味之外的回苦味严重影响它们作为甜味剂的口感。研究表明修饰甜菊糖苷c-19位和/或c-13位亲水性取代基的类型、含量以及链接的方式能够对其味觉性质产生显著影响，因此为了进一步改善甜菊糖苷的味觉性质、开发具有广泛应用价值的天然甜味剂，本实验室前期挖掘了一种栀子来源糖基转移酶ugt94e13，可以催化reb d合成莱鲍迪苷m8(reb m8)。reb m8不仅甜味高于reb d，而且对于肿瘤坏死因子α具有更高的抑制活性。然而，ugt94e13催化reb d生成reb m8的反应效率过低，仅可以催化5mm的reb d，且反应时间较长，在12h后生成5.71g·l-1的reb m8。缓慢的反应效率无法满足工业需求，从而需要对ugt94e13进行催化活性提升。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术基于蛋白质结构的定向进化改造ugt94e13，提高其活性以满足reb m8的规模化生产，并通过构建尿苷二磷酸葡萄糖(udpg)循环体系，利用大肠杆菌
2、为了解决上述技术问题，本专利技术的技术方案如下：
3、本专利技术的第一个目的是提供一种高效的糖基转移酶突变体，所述突变体为将seqid no.1所示的糖基转移酶ugt94e13第169位的苯丙氨酸突变为甘氨酸，同时将第185位的异亮氨酸突变为甘氨酸。
4、在一种实施方式中，编码所述糖基转移酶ugt94e13的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述糖基转移酶突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示。
5、本专利技术的第二个目的是提供编码上述糖基转移酶突变体的基因。
6、本专利技术的第三个目的是提供携带编码上述糖基转移酶突变体的基因的表达载体。
7、本专利技术的第四个目的是提供表达上述糖基转移酶突变体的重组菌。
8、在一种实施方式中，所述重组菌还可以表达蔗糖合酶。
9、在一种实施方式中，所述蔗糖合酶的氨基酸序列可以是任意来源的具有蔗糖合酶活性的氨基酸序列。
10、在一种实施方式中，所述蔗糖合酶的氨基酸序列的ncbi登录号为np_001031915。
11、本专利技术的第五个目的是提供一种重组大肠杆菌，以pet-21b(+)为载体，表达所述糖基转移酶突变体；同时以pacycduet-1为载体，表达蔗糖合酶。
12、在一种实施方式中，编码所述糖基转移酶突变体ugt94e13-f169g/i185g的氨基酸序列如seq id no.2所示。
13、在一种实施方式中，所述蔗糖合酶atsusy的氨基酸序列如seq id no.3所示；编码所述蔗糖合酶atsusy的核苷酸序列如seq id no.5所示。
14、本专利技术的第六个目的是提供一种提高糖基转移酶活力的方法，将氨基酸序列如seq id no.1所示的糖基转移酶ugt9413的第169位的苯丙氨酸突变为甘氨酸，同时将第185位的异亮氨酸突变为甘氨酸。
15、本专利技术的第七个目的是提供一种催化合成莱鲍迪苷m8的方法，所述方法为以rebd为底物，利用所述糖基转移酶突变体，或所述重组细胞，或所述重组菌的细胞裂解液进行催化反应。
16、在一种实施方式中，所述细胞裂解液为所述重组菌诱导表达后进行细胞裂解获得的上清液。
17、在一种实施方式中，所述催化反应的条件为：以1～25mmol/l reb d、1～1000mmol/l蔗糖、10～1000mmol/l kpi缓冲液，10～1000mmol/l nacl为反应体系，20～60℃糖基化反应1～50h。
18、在一种实施方式中，所述缓冲液ph为8.0。
19、本专利技术还保护上述糖基转移酶突变体或上述基因或上述表达载体或上述微生物细胞或上述重组菌或上述方法在制备含有莱鲍迪苷m8的产品中的应用。
20、有益效果：
21、(1)本专利技术将糖基转移酶ugt94e13的氨基酸序列进行定点突变，得到最优突变体，显著提高糖苷转移酶ugt94e13-f169g/i185g在以udpg为糖基供体，催化reb d合成reb m8的效率，kcat/km大幅提升至24.37mm-1min-1，相对酶活力达到了野生型酶的13.90倍。
22、(2)本专利技术构建的重组菌株共表达栀子来源糖基转移酶突变体ugt94e13-f169g/i185g和拟南芥来源蔗糖合酶atsusy，利用重组菌株诱导表达后制备得到的细胞裂解液催化reb d合成reb m8。通过偶联反应体系条件优化，实现利用28.23g/l(25mmol/l)reb d以98.12％的高产率合成31.68g/l(24.53mmol/l)的reb m8。
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1.一种糖基转移酶突变体，其特点在于，将SEQ ID NO.1所示的糖基转移酶UGT94E13第169位的苯丙氨酸突变为甘氨酸，同时将第185位的异亮氨酸突变为甘氨酸。
2.编码权利要求1所述糖基转移酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述的基因的重组载体。
4.表达权利要求1所述的糖基转移酶突变体、或含有权利要求2所述的基因、或含有权利要求3所述的重组载体的重组细胞，其特征在于，以细菌或真菌为表达宿主。
5.如权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，还表达蔗糖合酶。
6.如权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，以pET-21b(+)为载体，表达权利要求1所述糖基转移酶突变体；同时以pACYCDuet-1为载体，表达蔗糖合酶。
7.一种提高糖基转移酶活力的方法，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的糖基转移酶UGT9413的第169位的苯丙氨酸突变为甘氨酸，同时将第185位的异亮氨酸突变为甘氨酸。
8.一种催化合成莱鲍迪苷M8的方法，其特征在于，向含有莱鲍迪苷D的反
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述反应体系中含有1～25mmol/L莱鲍迪苷D、10～1000mmol/L KPi缓冲液和10～1000mmol/L NaCl。
10.权利要求1所述的糖基转移酶突变体、或权利要求2所述的基因、或权利要求4～6任一所述的重组细胞在制备含有莱鲍迪苷M8的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种糖基转移酶突变体，其特点在于，将seq id no.1所示的糖基转移酶ugt94e13第169位的苯丙氨酸突变为甘氨酸，同时将第185位的异亮氨酸突变为甘氨酸。
2.编码权利要求1所述糖基转移酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述的基因的重组载体。
4.表达权利要求1所述的糖基转移酶突变体、或含有权利要求2所述的基因、或含有权利要求3所述的重组载体的重组细胞，其特征在于，以细菌或真菌为表达宿主。
5.如权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，还表达蔗糖合酶。
6.如权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，以pet-21b(+)为载体，表达权利要求1所述糖基转移酶突变体；同时以pacycduet-1为载体，表达蔗糖合酶。
7.一种提高...
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