【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物标志物检测领域，具体涉及一种基于单颗粒示踪的痕量肿瘤生物标志物检测平台及方法。
技术介绍
1、生物标志物的快速检测和精确定量对于疾病的诊断和治疗至关重要。目前临床中用于生物分子检测的仪器设备主要分为两类：一类是精密设备，其检测性能较好，如检测限低、灵敏度高，但是这类仪器一般体积较大，检测成本高，并且需要专业人员进行操作和维护；另一类是便携式设备，这类设备一般用于快速检测，在救护车或重症监护室内应用广泛，但是其检测限及其他分析指标有限。因此，亟待搭建一种快速、灵敏、精确的传感平台用于生物分子的检测，以满足不断提高的检测限、动态范围及检测时间等方面的需求。
2、近年来，为提升仪器的检测性能，人们发展了数字免疫分析方法。该方法的实质是通过计算单个生物标志物与抗体的结合量来确定生物标志物的浓度。其中一种数字免疫分析方法是基于酶联免疫分析试验，目标生物分子与抗体包被的磁性纳米颗粒结合，分装在微孔中，通过酶反应放大信号并进行检测；另外一种是结合单分子荧光检测和流式细胞术的数字免疫分析方法。以上数字免疫分析法提高了传统酶联免疫分析试验的检测限和准确度，但是其操作方法复杂，步骤繁多，增加了检测的复杂度、成本和时间，这些缺点影响了其在临床诊断中的应用。
3、有鉴于此，确有必要设计一种基于单颗粒示踪的痕量肿瘤生物标志物检测平台及方法，以解决上述问题。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种基于单颗粒示踪的痕量肿瘤生物标志物检测平台及方法。
3、第一方面，本专利技术提供一种基于单颗粒示踪的痕量肿瘤生物标志物检测平台，包括：
4、单颗粒成像模块，包括激光光源、暗场聚光器和光学显微放大物镜；
5、样品反应模块，包括玻片传感基底、用于固定捕获抗体的化学修饰层、用于放置样品溶液的样品池、生物分子封端剂、待测生物分子结合对及单个纳米颗粒；
6、单颗粒图像记录模块，包括用于转换光路方向的反射镜以及图像传感器。
7、作为本专利技术的进一步改进，所述激光光源、所述暗场聚光器、所述玻片传感基底及所述光学显微放大物镜自上而下同向安装，激光经由所述暗场聚光器落射至所述玻片传感基底，基于所述待测生物分子结合对固定在所述玻片传感基底表面上的所述纳米颗粒受激发产生局域表面等离激元共振效应，其散射信号依次通过所述光学显微放大物镜及所述反射镜进入所述图像传感器。
8、作为本专利技术的进一步改进，所述暗场聚光器为干式聚光器，数值孔径为0.80-0.95，所述光学显微放大物镜的放大倍数为20，数值孔径为0.45。
9、作为本专利技术的进一步改进，所述样品池置于所述玻片传感基底的表面，通过所述化学修饰层固定所述待测生物分子结合对，利用所述生物分子封端剂封闭所述玻片传感基底的表面的剩余活性位点，所述纳米颗粒表面修饰能够与所述待测生物分子结合对特异耦合的生物分子，通过特异性生物分子相互作用，所述纳米颗粒结合至所述玻片传感基底的表面。
10、作为本专利技术的进一步改进，所述图像传感器为ccd图像传感器或cmos图像传感器。
11、第二方面，本专利技术提供一种基于单颗粒示踪的痕量肿瘤生物标志物检测方法，所述方法采用上述搭建的平台，所述方法包括如下步骤：
12、步骤1、肿瘤生物标志物结合至基底表面；
13、步骤2、纳米颗粒结合至所述基底表面；
14、步骤3、采集所述纳米颗粒的暗场散射图像，获取所述纳米颗粒在结合过程中的颗粒数目和精确位置信息；
15、步骤4、根据所述纳米颗粒的颗粒数目和精确位置信息，实现肿瘤生物标志物痕量检测。
16、作为本专利技术的进一步改进，所述步骤1中，所述肿瘤生物标志物通过形成双抗夹心构型分子对，结合至所述基底表面，检测抗体采用生物素修饰。
17、作为本专利技术的进一步改进，所述步骤2中，所述纳米颗粒采用链霉亲和素修饰，通过链霉亲和素和生物素特异性相互作用结合至基底表面。
18、作为本专利技术的进一步改进，所述步骤3包括如下步骤：
19、步骤3.1、根据所述纳米颗粒在所述暗场散射图像中的特异性信号，从图像序列中识别单个所述纳米颗粒的图像，获取所述纳米颗粒的数目信号；
20、步骤3.2、选择所述图像的第一帧图像作为参考图像，得到所述纳米颗粒在所述参考图像和后续图像之间的二维空间相关性，确定单个所述纳米颗粒的光学强度；
21、步骤3.3、根据光学强度分布确定纳米颗粒中心，获取单个所述纳米颗粒的精确位置。
22、作为本专利技术的进一步改进，通过追踪不同肿瘤生物标志物浓度时，所述纳米颗粒的数目和精确位置随时间变化，获取纳米颗粒数目-浓度的标准曲线以及纳米颗粒运动轨迹-浓度的信息，实现肿瘤生物标志物的痕量检测。
23、本专利技术的有益效果为：
24、本专利技术的方法将单分子计数和粒子追踪相结合用于生物标志物的检测，不仅实现了对生物标志物的定量检测，也进行了动力学方面的轨迹分析。此外，该方法具有检测限低，检测仪器易得，检测方法简单、快速、灵敏，重复性好，不需专业培训，解决了现有检测方法复杂，检测时间长，成本高的问题。
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1.一种基于单颗粒示踪的痕量肿瘤生物标志物检测平台，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的基于单颗粒示踪的痕量肿瘤生物标志物检测平台，其特征在于：所述激光光源、所述暗场聚光器、所述玻片传感基底及所述光学显微放大物镜自上而下同向安装，激光经由所述暗场聚光器落射至所述玻片传感基底，基于所述待测生物分子结合对固定在所述玻片传感基底表面上的所述纳米颗粒受激发产生局域表面等离激元共振效应，其散射信号依次通过所述光学显微放大物镜及所述反射镜进入所述图像传感器。
3.根据权利要求1所述的基于单颗粒示踪的痕量肿瘤生物标志物检测平台，其特征在于：所述暗场聚光器为干式聚光器，数值孔径为0.80-0.95，所述光学显微放大物镜的放大倍数为20，数值孔径为0.45。
4.根据权利要求1所述的基于单颗粒示踪的痕量肿瘤生物标志物检测平台，其特征在于：所述样品池置于所述玻片传感基底的表面，通过所述化学修饰层固定所述待测生物分子结合对，利用所述生物分子封端剂封闭所述玻片传感基底的表面的剩余活性位点，所述纳米颗粒表面修饰能够与所述待测生物分子结合对特异耦合的生物分子，通过
5.根据权利要求1所述的基于单颗粒示踪的痕量肿瘤生物标志物检测平台，其特征在于：所述图像传感器为CCD图像传感器或CMOS图像传感器。
6.一种基于单颗粒示踪的痕量肿瘤生物标志物检测方法，其特征在于，所述方法采用权利要求1-5任意一项的所述平台，所述方法包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的基于单颗粒示踪的痕量肿瘤生物标志物检测方法，其特征在于：所述步骤1中，所述肿瘤生物标志物通过形成双抗夹心构型分子对，结合至所述基底表面，检测抗体采用生物素修饰。
8.根据权利要求6所述的基于单颗粒示踪的痕量肿瘤生物标志物检测方法，其特征在于：所述步骤2中，所述纳米颗粒采用链霉亲和素修饰，通过链霉亲和素和生物素特异性相互作用结合至基底表面。
9.根据权利要求6所述的基于单颗粒示踪的痕量肿瘤生物标志物检测方法，其特征在于：所述步骤3包括如下步骤：
10.根据权利要求6所述的基于单颗粒示踪的痕量肿瘤生物标志物检测方法，其特征在于：通过追踪不同肿瘤生物标志物浓度时，所述纳米颗粒的数目和精确位置随时间变化，获取纳米颗粒数目-浓度的标准曲线以及纳米颗粒运动轨迹-浓度的信息，实现肿瘤生物标志物的痕量检测。
...【技术特征摘要】
1.一种基于单颗粒示踪的痕量肿瘤生物标志物检测平台，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的基于单颗粒示踪的痕量肿瘤生物标志物检测平台，其特征在于：所述激光光源、所述暗场聚光器、所述玻片传感基底及所述光学显微放大物镜自上而下同向安装，激光经由所述暗场聚光器落射至所述玻片传感基底，基于所述待测生物分子结合对固定在所述玻片传感基底表面上的所述纳米颗粒受激发产生局域表面等离激元共振效应，其散射信号依次通过所述光学显微放大物镜及所述反射镜进入所述图像传感器。
3.根据权利要求1所述的基于单颗粒示踪的痕量肿瘤生物标志物检测平台，其特征在于：所述暗场聚光器为干式聚光器，数值孔径为0.80-0.95，所述光学显微放大物镜的放大倍数为20，数值孔径为0.45。
4.根据权利要求1所述的基于单颗粒示踪的痕量肿瘤生物标志物检测平台，其特征在于：所述样品池置于所述玻片传感基底的表面，通过所述化学修饰层固定所述待测生物分子结合对，利用所述生物分子封端剂封闭所述玻片传感基底的表面的剩余活性位点，所述纳米颗粒表面修饰能够与所述待测生物分子结合对特异耦合的生物分子，通过特异性生物分子相互作用，所述纳米颗粒结合至所述玻片传感基底的表面。
【专利技术属性】
技术研发人员：王毅，齐礼婷，王亚敏，孙乐，张磊，范曲立，
申请(专利权)人：南京邮电大学，
类型：发明
国别省市：
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