本发明专利技术公开了一种抗氧化能力遗传风险评估的基因检测方法，其特征在于，通过同时检测分析个体的ＣＡＴ基因、ＣＹＢＡ基因、ＮＯＳ３基因、ＳＯＤ３基因、ＰＯＮ１基因ＳＮＰｓ位点基因携带型为所有的受检者提供抗氧化能力的遗传风险评估、相关疾病风险规避的个性化健康指导。本发明专利技术的优点是在疾病发生之前，从遗传角度提示受检者与自由基相关的疾病发生风险，提高受检者的自我保健意识，积极采用合理的干预手段，达到降低疾病发生可能的目的；从分子机理角度分析疾病的致病因素以及发病机理，加深对疾病的认识，并可促进相应诊疗措施的制定，提高治疗效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，用于评估个体抗 氧化能力的强弱，针对性地提示受检者面对各种可能导致氧化损伤的外界因素时 应采取的恰当应对措施，属于分子生物学
技术介绍
人体内存在着一个非常重要的平衡系统氧化一还原系统，这一系统调节着 体内氧自由基的产生和代谢，维持着体内适当的氧化能力和氧自由基的清除能 力，从而保障了生命活动的进行。氧化作用为人体提供生命活动所需要的能量，而随之产生的"副产品"_氧 自由基的过多积累却会在分子水平上损伤机体的正常机能，体内氧化一还原系统 功能的失衡会导致人体一系列的疾病，氧化一还原系统失衡、过多氧自由基的积 累会引起一系列的心脑血管、神经系统、消化系统等疾病以及过早的衰老，因此 抗氧化能力在人的生命活动中十分重要。无论是氧自由基还是活性氧均来自氧分子，氧分子进行单电子还原反应生成 氧自由基或活性氧，在生物体内氧自由基或活性氧主要通过自然氧化、酶氧化、 线粒体、毒物作用等途径产生，正常情况下自由基的形成量极少，寿命也短，故 不会构成对机体的危害，即使有所增多，由于机体具有自由基的清除系统，因此 也不会造成严重的损害，氧自由基和活性氧的清除主要通过两大系统1、 低分子清除剂均为一些低分子化合物，具有抗氧化作用，又称低分子抗氧化剂，这些 物质包括维生素E、 A、 C、还原型谷胱甘肽(GSH)、 N0等等；2、 酶性清除剂大致有超氧化物歧化酶(S0D)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶等几种。正常机体内不时地产生着自由基和活性氧，正常情况下起着代谢储能、转化排泄、防御杀菌和抗肿瘤作用；过多的自由基对机体造成很明显的损害作用1、 将不饱和脂肪酸转变成过氧化脂质，导致生物膜的流动性下降和变形能 力下降，脆性增加，膜受体、离子通道等功能均受影响；膜的通透性升 高，细胞内外离子分布异常；2、 自由基会引起蛋白质的非正常交联、聚合和肽链的断裂，也可以使蛋白 质与脂质结合生成聚合物，丧失蛋白功能；也可能修饰酶上氨基酸，使 酶活性异常；3、 与碱基加成反应，引起基因突变、DNA断裂；还能引起染色体畸变；4、 使得细胞外基质的胶原蛋白发生交联，降解透明质酸，引起基质疏松和 弹性下降，衰老时的皱纹与此有关。氧自由基在体内如果不能及时清除，会参与多种疾病的发生，自1954年 Haraian提出衰老自由基理论以来，越来越多实验从分子水平说明自由基引起衰 老生理变化，研究表明自由基与70多种疾病致病有关，自由基会参与肿瘤、早 衰和皮肤病、冠心病、糖尿病、白内障、辐射病、消化道溃疡、乙肝及肝硬化、 肾脏疾病等，同时，吸烟危害健康，其相当一部分危害亦是由自由基造成，自由 基对细胞和组织的损伤是其致病的基础。抗氧化易感遗传风险缺陷可造成自由基在体内的过量蓄积，而过量的自由基会严重危害人体的健康，例如1. 自由基摧毁细胞膜，导致细胞膜发生变性，使细胞不能从外部吸收营养，也排泄不出细胞内的代谢废物，并走失了对细菌和病毒的抵御能力；2. 自由基攻击正在复制中的基因，造成基因突变诱发癌症发生；3. 自由基激活人体的免疫系统，使人体表现出过敏反应，或出现如红斑狼 疮等的自体免疫疾病；4. 自由基侵蚀机体组织，可激发人体释放各种炎症因子，导致出各种非菌 性炎症；5. 自由基侵蚀脑细胞，使人得早老性痴呆的疾病；6. 自由基氧化血液中的脂蛋白造成胆固醇向血管壁的沉积，引起心脏病和 中风；7. 自由基引起关节膜及关节滑液的降解，从而导致关节炎；8. 自由基侵蚀眼睛晶状体组织引起白内障；9. 自由基侵蚀胰脏细胞引起糖尿病。不同的人在相同的环境下抗氧化能力是不同的，因此遗传体质不同的人有着 不同水平的抗氧化能力，面对着不同的抗氧化能力缺陷风险，应对风险需要采取 不同的策略，因此，综合利用现代科学研究成果，开发一项基于分子遗传基础的 抗氧化易感遗传风险检测及个性化干预提示产品会对由于抗氧化能力缺陷而引 起疾病的发生起到预警、个性化防治的提示作用，具有很强的社会意义和市场前 景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗氧化能力遗传风险评估的方法，可以让受检者了 解自身基因抗氧化能力的强弱，加强对可能发生基因损伤的环境的辨别能力，采 取适当措施防止或降低基因损伤的程度，从而有效减少由于基因损伤带来的疾病 风险。为实现以上目的，本专利技术的技术方案是提供一种DNA损伤修复能力遗传风险评估的方法，其特征在于，其方法为 步骤l.检测的样品类型与采样方法用采样拭在20-30个被测者口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮40 次以上，以保证采集到足量的细胞样本； 步骤2.基因组DNA的抽提方法采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小 时一2.5小时，共抽提20 — 30个被测者样本，经电泳检测后，用肉眼可 见清晰白色条带即可判断获得的DNA能进入下一步检测； 步骤3:荧光定量PCR反应将每一个被测者样本分别放入5个反应孔，同时检测5个位点，即过氧化氢 酶(CAT) SEQ IDN01: rs769214、还原型辅酶叶绿醇(CYBA) SEQ IDN02: rs4673、 内皮型一氧化氮合成酶(N0S3) SEQ IDN03、胞外过氧化物岐化酶(S0D3) SEQ ID N04: rsl799895、对氧磷酯酶1 (P0N1) SEQ ID N05: rs662; 20 — 30个被测者 样本就有100-150个反应孔，另外根据实验需要增设不含DNA模版的NTC空白对照孔，每一个反应孔的基因分型根据下表的引物和探针设计，采用TaqMan "MGB 技术，进行检测试剂合成；在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为10W，即 浓度为20ng/pl的DNA模板、1^1 10X荧光定量PCR反应缓冲液ABI Taqman MGB、 0. 25raM d NTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0. 25mM MgCl2 溶液、0.02h4 (5units/W) Taq DNA聚合酶、去离子水5.43W、 5个位点分别 采用不同的正向引物(20,， 0.225W)、反向引物(20,， 0.225W)、 VIC荧光探针(IO幽，0. 和FAM荧光探针(IO幽，0. 工具进行检测，详见下表；<table>table see original document page 8</column></row><table>将反应板放在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，先进行预热50°C、 2分 钟，95°C、 IO分钟，然后再进行60个循环的95。C、 30秒，60°C、 1分钟、反应 结束后取出后再放入ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，并自动将 20—30个被测者样本检测5个点位的数据对号入座到5个图中，同时生成5张 图，即过氧化氢酶(CAT) SEQ ID N01: rs769214图、还原型辅酶叶绿醇(CYBA) SEQIDN02: rs4673图、内皮型一氧化氮合成酶(N0S3) SEQ ID N03: rsl799983 图、胞外过氧化物岐化酶(S0D3)SEQ IDN04: rsl799895图、对氧磷酯酶1 (P0N1) SEQ ID 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗氧化能力遗传风险评估的基因检测方法，其特征在于，其方法为： 步骤１．检测的样品类型与采样方法： 用采样拭在２０－３０个被测者口腔中分别左右两腮至少需要各上下刮４０次以上，以保证采集到足量的细胞样本； 步骤２．基因组Ｄ ＮＡ的抽提方法： 采用硅胶吸附法抽提每一个口腔上皮细胞样本的基因组ＤＮＡ，时间为２小时－２．５小时，共抽提２０－３０个被测者样本，经电泳检测后，用肉眼可见清晰白色条带即可判断获得的ＤＮＡ能进入下一步检测； 步骤３：荧光定量ＰＣＲ 反应 将每一个被测者样本分别放入５个反应孔，同时检测５个位点，即过氧化氢酶（ＣＡＴ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１：ｒｓ７６９２１４、还原型辅酶叶绿醇（ＣＹＢＡ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２：ｒｓ４６７３、内皮型一氧化氮合成酶（ＮＯＳ３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３：ｒｓ１７９９９８３、胞外过氧化物岐化酶（ＳＯＤ３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４：ｒｓ１７９９８９５和对氧磷酯酶１（ＰＯＮ１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ５：ｒｓ６６２５个位点；２０－３０个被测者样本就有１００－１５０个反应孔，并增设不含ＤＮＡ模版的ＮＴＣ空白对照孔； 每一个反应孔的基因分型可以根据下表的引物和探针设计，采用ＴａｑＭａｎ＊－ＭＧＢ技术，进行检测试剂合成； 在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量ＰＣＲ反应体系，总体积为１０μｌ，即浓度为２０ｎｇ／μｌ的ＤＮＡ模板２μ ｌ、１μｌ １０Ｘ荧光定量ＰＣＲ反应缓冲液ＡＢＩ Ｔａｑｍａｎ＊ ＭＧＢ、０．１μｌ ２５ｍＭ ｄ ＮＴＰ合成ＤＮＡ的四种脱氧核苷酸底物、０．５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ↓［２］溶液、０．０２μｌ（５ｕｎｉｔｓ／μｌ）Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、 去离子水５．４３μｌ、５个位点分别采用不同的正向引物（２０μＭ，０．２２５μｌ）、反向引物（２０μＭ，０．２２５μｌ）、ＶＩＣ荧光探针（１０μＭ，０．２５μｌ）和ＦＡＭ荧光探针（１０μＭ，０．２５μｌ）工具进行检测； 将反应板放在ＡＢ Ｉ９７００型ＰＣＲ扩增仪上进行反应，先进行预热：５０℃、２分钟，９５℃、１０分钟，然后再进行６０个循环的９５℃、３０秒，６０℃、１分钟检测，经重复实验验证，基因分型的准确率达到了９９％以上，重复性达到了１００％。 反应结束后取出后再放 入ＡＢＩ７９００型荧光定量ＰＣＲ仪上读取样品荧光量，并自动将２６个被测者样本检测５个点位的数据对号入座到５个图中，同时生成５张...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：傅咏南，毛丹丹，张同燕，
申请(专利权)人：上海中优医药高科技有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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