人清道夫受体ＣＤ３６拮抗剂筛选模型及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种以人清道夫受体（ＣＤ３６）为靶点的ＣＤ３６拮抗剂体外高通量筛选模型，本发明专利技术还涉及一种利用所述筛选模型筛选人清道夫受体（ＣＤ３６）拮抗剂的方法，以及利用所述模型筛选获得的人清道夫受体（ＣＤ３６）拮抗剂。

【技术实现步骤摘要】
人清道夫受体CD36拮抗剂筛选模型及其应用专利
本专利技术涉及一种以人清道夫受体CD36为靶点的人清道夫受体CD36拮抗剂之体外高通量筛选模型，本专利技术还涉及一种利用所述筛选模型筛选人清道夫受体CD36拮抗剂的方法，以及利用所述模型筛选获得的人清道夫受体CD36拮抗剂。专利技术背景动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是多种严重心血管疾病的病理基础。其中冠状动脉粥样硬化性心脏病即冠心病是我国目前城乡居民死亡率最高的疾病，约占总死亡人数的百分之四十。因此寻找预防和治疗动脉粥样硬化的药物十分迫切，并具有重要的现实意义。大量流行病学资料显示，血液中低密度脂蛋白(Low densitylipoprotein，LDL)的升高是引起动脉粥样硬化的主要危险因素。与动脉粥样硬化的关系更为重要的是CD36作为清道夫受体结合OxLDL(Suzuki，H.，等人，巨噬细胞清道夫受体在动脉粥样硬化中的作用以及对感染的敏感性(A role for macrophage scavenger receptors inatherosclerosis and susceptibility to infection)，Nature，1997；386：292  296)。LDL在血管内的修饰是动脉粥样硬化早期的事件之一，CD36作为重要的受体参与识别和内吞变性LDL(modified LDL，mLDL，包括OxLDL和AcLDL)，导致泡沫细胞的形成，启动动脉粥样硬化的发生。CD36是动脉粥样硬化损伤部位巨噬细胞形成的泡沫细胞上的特征成分-->之一(Nakata A，Nakagwa Y，等人，一种用于氧化低密度脂蛋白的新型受体CD36在人动脉粥样硬化患者主动脉中脂质满载巨噬细胞中高表达(a novel receptor for oxidized low-density lipoproteins，ishighly expressed on lipid-laden macrophages in humanatherosclerotic aorta)，Arterioscler Thromb Vasc Biol，1999；19：1333-1339)。许多体内和体外的模型显示，60-90％的巨噬细胞泡沫化是依赖于CD36介导的。CD36缺失小鼠的巨噬细胞对于变性低密度脂蛋白的结合和降解分别下降74％和60％。CD36基因缺失对于apoE敲除的动物也具有显著的保护作用。以高脂饮食喂养的动物动脉损伤的面积和分布降低70％(Febbraio，M.，等人，鼠CD36中的无效突变显示在脂肪酸和脂质蛋白代谢中的重要作用(A null mutation in murine CD36 revealsan important role in fatty acid and lipoprotein metabolism)，J Biol Chem，1999；274：19055 19062)。从遗传缺陷CD36的病人分离得到的巨噬细胞与正常巨噬细胞相比，OxLDL和胆固醇酯的结合量均下降40％。(Silverstein，R.L.，和Febbraio，M.CD36和动脉粥样硬化(CD36 and atherosclerosis)，Curr Opin Lipidol，2000；11：483491)。因此阻断清道夫受体CD36的功能将大大地保护动物的动脉粥样硬化损伤，被认为是具有希望的抗动脉粥样硬化的治疗靶点。因此，在体外构建高通量筛选模型，寻找CD36拮抗剂，将有可能获得可以拮抗CD36清道夫受体功能的活性化合物，为预防和治疗动脉粥样硬化的新型先导化合物的发现奠定基础。为解决上述技术问题，本专利技术人利用杆状病毒昆虫细胞表达系统，在昆虫细胞Sf9细胞膜上成功表达了具有生物学活性的人清道夫受体CD36，首次成功建立CD36拮抗剂的体外高通量筛选模型。利用该模型筛选了大量样品，成功获得了具有阳性活性的候选化合物和发酵液提取物。-->
技术实现思路
本专利技术的一个方面，涉及一种以人清道夫受体CD36为靶点的人清道夫受体CD36拮抗剂高通量筛选模型，其包括：1)经重组杆状病毒BG-CD36感染可在其细胞膜上表达人CD36的重组昆虫细胞Sf9；以及2)CD36荧光配基DiI-AcLDL，即：1，1’-双十八烷基-3，3，3，3’，3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(1，1’-dioctadecy1-3-3-3’-3’-tetfamethyllindocarbocyanine perchlorate)乙酰化低密度脂蛋白(以下缩写为DiI-AcLDL)。在本专利技术的一个实施方案中，所述的筛选模型中的重组昆虫细胞Sf9是通过如下方法制备的：在96孔板中每孔接种对数生长期的细胞5×104个于不含FBS、抗生素的Grace培养基，贴壁后按MOI为5的量接种重组杆状病毒BG-CD36，感染后培养60-96小时，优选为感染后72小时；其中所述CD36配基DiI-AcLDL的浓度为0.25-2μg/ml，优选为1.0μg/ml。在本专利技术中，所述CD36受体拮抗剂指与不加入所述拮抗剂相比，抑制、降低、或阻断所述CD36清道夫受体活性至少10％，优选的20％，更优选的30％，甚至更优选的40％，最优选的高于50％以上的物质，其可来源于，例如，天然产物库，化合物库，微生物发酵产物库等。本专利技术又一方面，还涉及一种利用所述筛选模型筛选以人CD36为靶点的CD36拮抗剂方法，包括：1)在96孔板中每孔接种对数生长期的细胞5×104个于不含FBS、抗生素的Grace培养基，贴壁后按MOI为5的量接种重组杆状病毒BG-CD36，感染后培养60-96小时，优选为感染后72小时；2)用不含FBS、抗生素的Grace培养基洗涤步骤1)中所获得的表达CD36的重组昆虫细胞Sf9；3)向步骤2)中所获得的重组昆虫细胞Sf9中加入浓度为0.25-5μg/ml荧光配基DiI-AcLDL 50μl，随后加入浓度为10μg/ml的待测化合物或经适当稀释的微生物发酵产物50μl；-->4)将步骤3)所得混合物于27℃孵育6小时，吸弃上清，用pH7.2的PBS洗涤，最后加入100μl PBS，在激发光540nm/发射光590nm下，读取荧光读数；5)所述荧光读数与同样经上述步骤1)-4)处理的用空载体病毒BG感染昆虫细胞的阴性对照荧光读数相比，所得样品抑制率大于20％的判定为CD36拮抗剂。在本专利技术中，所述样品抑制率采用如下公式计算：抑制率(％)＝(样品细胞组-重组细胞组)/(重组细胞组-阴性对照组)×100％。本专利技术的又一方面涉及所述筛选模型用于筛选清道夫受体CD36拮抗剂的用途。本专利技术再一方面还涉及利用本专利技术所述的方法筛选得到的清道夫受体CD36拮抗剂。本专利技术所述筛选模型利用DiI-AcLDL为配基，以在昆虫细胞Sf9的细胞膜上成功表达的CD36为靶点，建立了CD36拮抗剂筛选模型，其特点在于与现有的体外受体配基结合模型相比较，作为筛选靶点人清道夫受体CD36在昆虫细胞膜上表达，因此，不仅避免了受体的纯化和分离步骤，而且，本专利技术所采用的筛选模型中，通过荧光检测反映出所述受体与待测化合物之间的相互作用更接近在人体细胞中的真本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以人清道夫受体ＣＤ３６为靶点的人清道夫受体ＣＤ３６拮抗剂高通量筛选模型，其包括：　１）经重组杆状病毒ＢＧ－ＣＤ３６感染可在其细胞膜上表达人清道夫受体ＣＤ３６的重组昆虫细胞Ｓｆ９；２）ＣＤ３６荧光配基ＤｉＩ－ＡｃＬＤＬ。

【技术特征摘要】
1.一种以人清道夫受体CD36为靶点的人清道夫受体CD36拮抗剂高通量筛选模型，其包括：1)经重组杆状病毒BG-CD36感染可在其细胞膜上表达人清道夫受体CD36的重组昆虫细胞Sf9；2)CD36荧光配基DiI-AcLDL。2.权利要求1所述的筛选模型，其中1)所述重组昆虫细胞Sf9是通过如下方法制备的：在96孔板中每孔接种对数生长期的细胞5×104个于不含FBS、抗生素的Grace培养基，贴壁后按MOI为5的量接种重组杆状病毒CD36，感染后培养60-96小时，优选为感染后72小时；2)所述人清道夫受体CD36荧光配基DiI-AcLDL的浓度为0.25-2.0μg/ml，优选为1.0μg/ml。3.一种利用权利要求1所述筛选模型筛选以人清道夫受体CD36为靶点的人清道夫受体CD36拮抗剂方法，包括：1)在96孔板中每孔接种对数生长期的细胞5×104个于不含FBS、抗生素的Grace培养基，贴壁后按MOI为5的量接种重组杆状病毒BG...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪斌，司书毅，王娟，鲍羿，解云英，姜威，巫烨翔，樊秀勇，王丽非，
申请(专利权)人：中国医学科学院医药生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]