一种快速高效的CAR-T细胞制备方法技术

技术编号：41809960 阅读：1 留言：0更新日期：2024-06-24 20:28

本发明专利技术提供了一种快速高效的CAR‑T细胞制备方法，包括如下步骤：(a)取PBMC细胞或T淋巴细胞，进行激活培养；(b)取携带CAR的重组载体转入步骤a激活培养后的细胞，转入时，在细胞培养基中添加F108终浓度为10ug/ml；(c)将步骤b获得的细胞液置于经RN、CD3抗体和CD28抗体包被的孔板，加入CAR‑T培养液，培养48h，即可。本发明专利技术方法制备CAR‑T细胞，阳性表达率和细胞活性好、且制备时间短，有效解决了CAR‑T阳性细胞不易获得、阳性细胞活力差的难题，而且本方法简单、制备成本低，应用前景良好。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于免疫学领域，具体涉及一种快速高效的car-t细胞制备方法。

技术介绍

1、嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor t cell，car-t)治疗技术，是近年来迅速发展起来的新型免疫治疗手段，已经在急/慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤等非实体瘤中展现出了极强的效果，被认为是最有前景的一种肿瘤治疗方式。随着car-t治疗越来越引起研究者们的关注，如何快速规模化地实现car-t细胞的生产，并保证产品的效力和稳定性，是大家面临的共同挑战。

2、cart细胞制备的一般过程，包括t细胞的富集和激活、car基因的转导，car-t细胞的扩增等步骤。但现阶段car-t细胞制备工艺尚不成熟，制备效率低，人car-t细胞制备通常需要9-14天，小鼠car-t细胞也需要6-9天。且阳性率与细胞活性常不能兼得，一般用电转方式能获得90％以上的阳性，但细胞活性容易受影响，电转仪设备成本较高。而用病毒感染的方法，对细胞活性影响稍小，但阳性率难以达到90％以上。

3、如何能够提高car-t细胞的阳性率和细胞活性，缩短生产时间、降低生产成本，是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本专利技术的目的在于提供一种快速、高效、低成本的car-t细胞制备方法。

2、本专利技术提供了一种快速高效的car-t细胞制备方法，包括如下步骤：

3、(a)取pbmc细胞或t淋巴细胞，进行激活培养；

<p>4、(b)取携带car的重组载体转入步骤a激活培养后的细胞，转入时，在细胞培养基中添加f108终浓度为10ug/ml；

5、(c)将步骤b获得的细胞液置于经rn、cd3抗体和cd28抗体包被的孔板，加入car-t培养液，培养48h，即可；

6、其中，所述car-t培养液加入后，使得培养体系中包括：il-2100u/ml、甲基β环糊精或β环糊精0.5umol/l、胆固醇2ug/ml。

7、其中，在步骤(c)中，培养24h后，还包括收集细胞，再次取携带car的重组载体按步骤b的方法二次转入的步骤。

8、其中，二次转入后，加入car-t培养液，继续培养24h。

9、其中，步骤(a)中，所述激活培养的方法为：将细胞接种于含有终浓度为1ug/ml的cd28抗体、1ug/ml的cd3抗体、100u/ml的il-2的基础培养基，培养24小时；

10、优选地，所述基础培养基为添加10％fbs的x-vivo培养基。

11、其中，步骤(b)中，转入时，还添加终浓度为0.5ng/ml的鱼精蛋白。

12、其中，步骤(b)中，所述转入的方法为病毒颗粒感染或转染；

13、优选地，所述病毒颗粒为慢病毒，病毒的加入量为moi＝10；

14、所述转染为电转。

15、其中，所述感染的方法如下：

16、(1)将激活培养后的细胞离心、用细胞培养基重悬，加入终浓度为10ug/ml的f108于37℃孵育15min；

17、(2)将携带car的重组慢病毒，与终浓度为0.5μg/ml的鱼精蛋白于37℃孵育15min；

18、(3)两者混合，于37℃孵育15min。

19、其中，步骤(b)中，所述细胞培养基为添加10％fbs、5ng/ml il-7和5ng/ml il-15的x-vivo培养基。

20、其中，步骤(c)中，所述包被的方法为：

21、配制混合溶液：每1.5ml中，包含rn20ul、cd28抗体1.5ug和cd3抗体1.5ug，其余为pbs；包板，避光、密封，4℃，24h。

22、本专利技术还提供了上述方法制备的car-t细胞。

23、本专利技术方法通过对car-t细胞制备的步骤及参数进行优化，制备的car-t细胞阳性表达率和细胞活性好、且制备时间短，将car-t细胞制备时间从9-14天(人)和6-9天(小鼠)缩短到3天(人/鼠)，阳性率能稳定在90％以上，并且细胞活性在95％以上，状态良好，且能保证阳性细胞数量。有效解决了car-t阳性细胞不易获得、阳性细胞活力差的难题，提高了car-t细胞的制备效率，可广泛应用于各种car-t药物的制备。而且本方法简单、制备成本低，应用前景良好。

24、显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

25、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。

本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种快速高效的CAR-T细胞制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(c)中，培养24h后，还包括收集细胞，再次取携带CAR的重组载体按步骤b的方法二次转入的步骤。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：二次转入后，加入CAR-T培养液，继续培养24h。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(a)中，所述激活培养的方法为：将细胞接种于含有终浓度为1ug/ml的CD28抗体、1ug/ml的CD3抗体、100U/ml的IL-2的基础培养基，培养24小时；

5.根据权利要求1-3任意一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(b)中，转入时，还添加终浓度为0.5ng/ml的鱼精蛋白。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(b)中，所述转入的方法为病毒颗粒感染或转染；

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述感染的方法如下：

8.根据权利要求1-7任意一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(b)中，所述

9.根据权利要求1-3任意一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(c)中，所述包被的方法为：

10.权利要求1-9任意一项方法制备的CAR-T细胞。

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【技术特征摘要】

1.一种快速高效的car-t细胞制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(c)中，培养24h后，还包括收集细胞，再次取携带car的重组载体按步骤b的方法二次转入的步骤。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：二次转入后，加入car-t培养液，继续培养24h。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(a)中，所述激活培养的方法为：将细胞接种于含有终浓度为1ug/ml的cd28抗体、1ug/ml的cd3抗体、100u/ml的il-2的基础培养基，培养24小时；

5.根据权利要求1-3任意一项所述的制备方...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜云瀚，郭应强，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：

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