【技术实现步骤摘要】
本申请涉及生物医药，尤其是涉及一种具有免疫调节、抗炎和抗纤维化功能的间充质干细胞来源外泌体细分亚群及其制备方法和在一些炎症相关疾病更有效创新药商业开发上的应用。
技术介绍
1、间充质干细胞(mesenchymal stem cells,mscs)，也可以定义为多能间充质基质细胞，具有多种独特特征，包括分化潜力、集落形成和自我更新能力。它们可以分化为间充质谱系细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞和心肌细胞，以及非间充质谱系细胞，如肝细胞和神经元细胞类型。mscs几乎存在于所有组织中，并参与组织再生和稳态维持。mscs的免疫抑制特性已在炎症和自身免疫性疾病的临床前研究和试验中得到证实。研究人员发现mscs到达损伤部位后并不增殖而是主要通过旁分泌调控发挥作用，而分泌细胞外囊泡(extracellular vesicles,evs)-外泌体(exosomes)或微囊泡(microvesicles)，是其发挥作用的主要机制。通过囊泡内含有的rna、蛋白质或其它分子，mscs来源的evs已被证明具有与亲本细胞相似的治疗特性，能够影响组织对于损伤、感染和疾病的反应，调节细胞和细胞之间的互作，进行细胞信号转导并改变组织和细胞的代谢。此外，与mscs相比，外泌体储存方便，能够转运活性分子，并且可以规避干细胞治疗带来的致瘤性和免疫原性风险，因此，外泌体作为一种新兴的“cell-free”治疗手段在临床疾病的治疗中具有更为广阔的发展前景。
2、当释放到细胞外微环境中时，evs在转移生物活性物质方面发挥着不可或缺的作用，如功能性m
3、近年来，mscs在临床治疗的适应症已经超过130种，其中大多数研究已经进入临床试验阶段并陆续有mscs药物获批上市，也有报道称干细胞治疗无效或缺乏稳定性。干细胞治疗产生不同效果可能归因于干细胞在不同环境或生理状态下产生的外泌体组分存在差异。虽然mscs外泌体与mscs相比具有更多优势，同样，难以规避的异质性，也阻碍了其临床应用进程，这些问题归根到底与亚群的特定功能和分子组分的研究不足有关。因此，分离出具有不同表征和功能的外泌体亚群，对其蛋白质和核酸有效成分进行严格定义是其应用于临床的基础。
技术实现思路
1、解决的技术问题：为了开发出差异化及更有效的外泌体细分亚群，本专利技术提供具有免疫调节、抗炎和抗纤维化功能的间充质干细胞来源外泌体细分亚群及其制备方法，并验证在一些炎症相关适应症创新药开发上的应用。细分亚群外泌体具有较高纯度和产量，并且具备特异的粒子径范围及表面标志物。此外，在功能上该细分亚群s1-exo具有更有效的免疫调节、抗炎、抗纤维化活性。本申请提供一种间充质干细胞外泌体细分亚群s1-exo的制备方法及应用。
2、技术方案：一种间充质干细胞外泌体亚群的制备方法，分离培养人脐带间充质干细胞，收集p5-p7代间充质干细胞的条件培养基上清，通过切向流系统+尺寸排阻色谱柱方法分离外泌体亚群，根据粒子径将外泌体亚群命名为s1-exo，粒子径范围峰值在120nm±15nm，平均粒径为130±15nm，表面标志物为hrs，hspa4，ras1b，a2m，syntenin-1，cd9，gpc1，dpp4，hsp90aa1，hsp90ab1，alix，cd81，tsg101，filamin-a。
3、上述制备方法的具体步骤为：s1、细胞选择：选取在对数生长期的7代以内，健康产妇分娩所得脐带来源的间充质干细胞；s2、细胞培养：选择dmem/f12培养基，含胎牛血清，血清浓度为10％，将步骤s1选取的间充质干细胞置于细胞培养基中培养，直至细胞融合度达到70％；s3、含外泌体的培养上清收集：去除步骤s2所用的培养基，并用pbs清洗3遍，而后补充加入无血清条件培养基，收集细胞培养上清液；s4、外泌体分离：将步骤s3得到的培养上清液，通过深层过滤去除大囊泡及凋亡小体，得到预处理上清液，将预处理上清液通过切向流超滤系统过滤和浓缩；s5、对上述过滤后的浓缩上清液，利用尺寸排阻色谱法及反向亲和层析制备外泌体亚群s1-exo。
4、上述制备方法制得的外泌体亚群s1-exo。
5、上述外泌体亚群s1-exo，其亚群特征为：粒子径范围峰值在120nm±15nm，平均粒径为130±15nm，表面标志物为hrs，hspa4，ras1b，a2m，syntenin-1，cd9，gpc1，dpp4，hsp90aa1，hsp90ab1，alix，cd81，tsg101，filamin-a。其中cd9，alix高表达；外泌体主要标志物分子cd63低表达，外泌体纯度不低于1.0e+8particles/μg蛋白质。
6、上述外泌体细分亚群s1-exo在免疫调节、抗炎创新药开发中的应用。
7、上述外泌体细分亚群s1-exo在治疗炎症性肠炎创新药开发中的应用。
8、上述外泌体细分亚群s1-exo在治疗肺纤维化创新本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种间充质干细胞来源外泌体细分亚群的制备方法，其特征在于：分离培养人脐带间充质干细胞，收集P5-P7代间充质干细胞的条件培养基上清，通过切向流系统+尺寸排阻色谱柱方法分离外泌体亚群，根据粒子径将外泌体亚群命名为S1-Exo，粒子径范围峰值在120nm+15nm，平均粒径为130+15nm，表面标志物为HRS，HSPA4，RAS1B，A2M，Syntenin-1，CD9，GPC1，DPP4，HSP90AA1，HSP90AB1，ALIX，CD81，TSG101，Filamin-A。
2.根据权利要求1所述的制备方法。其特征在于，步骤为：S1、细胞选择：选取在对数生长期的7代以内，健康产妇分娩所得脐带来源的间充质干细胞；S2、细胞培养：选择DMEM/F12培养基，含胎牛血清，血清浓度为10%，将步骤S1选取的间充质干细胞置于细胞培养基中培养，直至细胞融合度达到70％；S3、含外泌体的培养上清收集：去除步骤S2所用的培养基，并用PBS清洗3遍，而后补充加入无血清条件培养基，收集细胞培养上清液；S4、外泌体分离：将步骤S3得到的培养上清液，分别经过深层过滤去除大囊泡及凋亡小
3.权利要求1或2所述制备方法制得的外泌体亚群S1-Exo。
4.根据权利要求3所述外泌体亚群S1-Exo，其特征在于，亚群特征为：粒子径范围峰值在120nm+15nm，平均粒径为130+15nm，表面标志物为HRS，HSPA4，RAS1B，A2M，Syntenin-1，CD9，GPC1，DPP4，HSP90AA1，HSP90AB1，ALIX，CD81，TSG101，Filamin-A；其中CD9, ALIX高表达；外泌体主要标志物分子CD63低表达，外泌体纯度不低于1.0E+8 particles/μg蛋白质。
5.权利要求3所述外泌体细分亚群S1-Exo在免疫调节、抗炎创新药开发中的应用 。
6.权利要求3所述外泌体细分亚群S1-Exo在治疗炎症性肠炎创新药开发中的应用。
7.权利要求3所述外泌体细分亚群S1-Exo在治疗肺纤维化创新药开发中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞来源外泌体细分亚群的制备方法，其特征在于：分离培养人脐带间充质干细胞，收集p5-p7代间充质干细胞的条件培养基上清，通过切向流系统+尺寸排阻色谱柱方法分离外泌体亚群，根据粒子径将外泌体亚群命名为s1-exo，粒子径范围峰值在120nm+15nm，平均粒径为130+15nm，表面标志物为hrs，hspa4，ras1b，a2m，syntenin-1，cd9，gpc1，dpp4，hsp90aa1，hsp90ab1，alix，cd81，tsg101，filamin-a。
2.根据权利要求1所述的制备方法。其特征在于，步骤为：s1、细胞选择：选取在对数生长期的7代以内，健康产妇分娩所得脐带来源的间充质干细胞；s2、细胞培养：选择dmem/f12培养基，含胎牛血清，血清浓度为10%，将步骤s1选取的间充质干细胞置于细胞培养基中培养，直至细胞融合度达到70％；s3、含外泌体的培养上清收集：去除步骤s2所用的培养基，并用pbs清洗3遍，而后补充加入无血清条件培养基，收集细胞培养上清液；s4、外泌体分离：将步骤s3得到的培养上清液，分别经过深层过滤去除大囊泡及凋亡...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴庭鹤，李晶，刘伟，王新雨，
申请(专利权)人：南京科恩里斯生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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