【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程领域，更具体的是涉及一种用于去糖基化的n-糖酰胺酶f突变体及其重组基因。
技术介绍
1、糖基化是一种关键的生物学过程，通过在蛋白质上添加糖基来影响蛋白质的折叠、稳定性、分布和功能。它在生物医药领域特别重要，因为糖基化模式的变化常常与疾病的发展有关，也直接影响生物治疗药物的安全性和效力。例如，重组促红细胞生成素(epo)和单克隆抗体的疗效和药代动力学特性可以通过它们的糖基化模式来调节，这些模式影响药物的清除率、免疫原性和生物活性。
2、n-糖酰胺酶f(pngase f)是一个关键工具，用于研究蛋白质的糖基化。通过从蛋白质上特异性去除n-连接的聚糖，pngase f使科学家能够鉴定糖基化位点和研究糖链结构如何影响蛋白质功能。这一过程不仅对于理解蛋白质如何在健康和疾病状态下工作至关重要，也对于开发和优化生物治疗药物具有重要意义。
3、然而，pngase f的应用也面临挑战，特别是在非变性条件下去除糖基化。这对于保持蛋白质结构和功能完整性以及进行后续质谱分析尤为重要。例如，尽管pngase f可以有效去除人igg的糖基化，但在非变性条件下处理除此之外的其他蛋白质，如rnase b，其效果不佳。此外，当n-连接聚糖中的最内层glcnac与α-1,3-岩藻糖连接时，pngase f无法裂解这种结构，这限制了它的应用范围。因此，如何进一步拓宽该酶的底物范围且提高其酶活是目前亟待解决的问题。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的之
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种用于去糖基化的n-糖酰胺酶f(pngase f)突变体，其野生型序列如seq id no.1所示。该野生型n-糖酰胺酶f序列来源于基因文库uniport：p21163。
3、一种用于去糖基化的n-糖酰胺酶f突变体，n-糖酰胺酶f突变体以seq id no:1所述的n-糖酰胺酶f为母本，进行以下序列改造：
4、1)删除1～43位的氨基酸；
5、2)进行以下突变集进行突变：t72e+k84t+e137a+n150p；
6、所述氨基酸位点参照如seq id no：1所示的野生型n-糖酰胺酶f的氨基酸序列。
7、作为优选，一种用于去糖基化的n-糖酰胺酶f突变体，n-糖酰胺酶f突变体以seqid no：1的所示的野生型fdh为母本，序列改造除了包含1)和2)所述的序列改造，还包括以下突变集：3)
8、n48v/t/k+c91n+c96g+n109d+t111e+h205t+t206n/d/s/不突变，所述氨基酸位点参照如seq id no：1所示的野生型n-糖酰胺酶f的氨基酸序列。
9、作为优选，一种用于去糖基化的n-糖酰胺酶f突变体，所述n-糖酰胺酶f突变体以seq id no：1的所示的野生型fdh为母本，序列改造除了1)和2)和3)所述的序列改造，还包括以下突变：d172e，所述氨基酸位点参照如seq id no：1所示的野生型n-糖酰胺酶f的氨基酸序列。
10、作为优选，一种用于去糖基化的n-糖酰胺酶f突变体，所述n-糖酰胺酶f突变体以seq id no：1的所示的野生型fdh为母本，序列改造除了包含1)和2)所述的序列改造，还包括以下突变集：4)
11、r300f/h+d302h+v303e+n305p/d+s311k+f313h/y+s337i/m，所述氨基酸位点参照如seq id no：1所示的野生型n-糖酰胺酶f的氨基酸序列。
12、作为优选，一种用于去糖基化的n-糖酰胺酶f突变体，所述n-糖酰胺酶f突变体以seq id no：1的所示的野生型fdh为母本，序列改造除了包含1)+2)+4)所述的序列改造，还包括以下突变：i335l，所述氨基酸位点参照如seq id no：1所示的野生型n-糖酰胺酶f的氨基酸序列。
13、本专利技术的目的之二在于提供一种能够表达上述n-糖酰胺酶f突变体的遗传物质。
14、为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：
15、一种n-糖酰胺酶f重组遗传物质，能够表达上述n-糖酰胺酶f突变体的dna或rna。
16、本专利技术的目的之三在于提供一种能够表达上述n-糖酰胺酶f突变体的重组质粒。
17、为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：
18、一种n-糖酰胺酶f重组质粒，包括上述n-糖酰胺酶f重组基因。
19、本专利技术的目的之四在于提供一种能够表达上述n-糖酰胺酶f突变体的重组细胞。
20、为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种n-糖酰胺酶f重组细胞，包括上述n-糖酰胺酶f重组质粒。
21、与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术突变后的n-糖酰胺酶f突变体均表现出对人igg或rnase b(非变性)或辣根过氧化物酶的酶活改进特性。特别是，野生型pngasef对辣根过氧化物酶无酶切活性，pngase f突变体则均表现出对辣根过氧化物酶优异的酶切活性。尤其是，1.25μg的突变体pet28a-tbt12、pet28a-tbt15～pet28a-tbt17，分别能切除1μg辣根过氧化物酶95％以上的糖基。因此，本专利技术突变后的n-糖酰胺酶f的底物酶切范围更广，可以适用于更多糖蛋白的糖基检测中。
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1.一种用于去糖基化的N-糖酰胺酶F突变体，其特征在于所述N-糖酰胺酶F突变体以SEQ ID NO:1所述的N-糖酰胺酶F为母本，进行以下序列改造：
2.一种用于去糖基化的N-糖酰胺酶F突变体，其特征在于所述N-糖酰胺酶F突变体以SEQ ID NO：1的所示的野生型FDH为母本，序列改造除了包含权利要求1所述的序列改造，还包括以下突变集：
3.一种用于去糖基化的N-糖酰胺酶F突变体，其特征在于所述N-糖酰胺酶F突变体以SEQ ID NO：1的所示的野生型FDH为母本，序列改造除了包含权利要求2所述的序列改造，还包括以下突变：D172E，所述氨基酸位点参照如SEQ ID NO：1所示的野生型N-糖酰胺酶F的氨基酸序列。
4.一种用于去糖基化的N-糖酰胺酶F突变体，其特征在于所述N-糖酰胺酶F突变体以SEQ ID NO：1的所示的野生型FDH为母本，序列改造除了包含权利要求1所述的序列改造，还包括以下突变集：
5.一种用于去糖基化的N-糖酰胺酶F突变体，其特征在于所述N-糖酰胺酶F突变体以SEQ ID NO：1的所示的野生型FDH为母本
6.一种N-糖酰胺酶F的重组遗传物质，其特征在于能够表达如权利要求1～5任意一项所述的N-糖酰胺酶F突变体的DNA或RNA。
7.一种N-糖酰胺酶F的重组质粒，其特征在于包括如权利要求6所述的N-糖酰胺酶F的重组遗传物质。
8.一种N-糖酰胺酶F的重组细胞，其特征在于包括如权利要求7所述的N-糖酰胺酶F的重组质粒。
...【技术特征摘要】
1.一种用于去糖基化的n-糖酰胺酶f突变体，其特征在于所述n-糖酰胺酶f突变体以seq id no:1所述的n-糖酰胺酶f为母本，进行以下序列改造：
2.一种用于去糖基化的n-糖酰胺酶f突变体，其特征在于所述n-糖酰胺酶f突变体以seq id no：1的所示的野生型fdh为母本，序列改造除了包含权利要求1所述的序列改造，还包括以下突变集：
3.一种用于去糖基化的n-糖酰胺酶f突变体，其特征在于所述n-糖酰胺酶f突变体以seq id no：1的所示的野生型fdh为母本，序列改造除了包含权利要求2所述的序列改造，还包括以下突变：d172e，所述氨基酸位点参照如seq id no：1所示的野生型n-糖酰胺酶f的氨基酸序列。
4.一种用于去糖基化的n-糖酰胺酶f突变体，其特征在于所述n-糖酰胺酶f突变体以seq i...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈波，郭瑞阳，刘薇，邹梨，管佳威，
申请(专利权)人：杭州力文所生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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