【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，更具体的是涉及利用噬菌体表面展示技术，筛选出的能与羟基磷灰石特异性结合的四条羟基磷灰石结合七肽序列、淘选方法及其应用的。
技术介绍
1、龋病是最常见的口腔慢性感染性疾病，如不能进行有效的菌斑控制则病损将持续进展，并导致不可逆的牙髓炎症甚至根尖周组织和骨组织的破坏,已成为全球重大公共卫生问题。定期去除牙面菌斑和采取简便有效的方式抑制细菌在清洁牙面的再黏附和定植，抑制牙面生物膜的形成和调节口腔内菌群的微生态平衡的综合策略对口内细菌感染控制和龋病预防具有重要意义。但由于口腔内的复杂环境，如唾液等存在，目前口腔药物递送受限于难以控制和维持局部有效药物浓度。因此，采用合适的手段保持有效药物浓度成了我们要考虑的问题之一。
2、由于羟基磷灰石(hydroxyapatite，ha)是牙体硬组织的主要矿物成分，有研究通过对抗菌剂进行改性，添加羟基磷灰石结合基团，使其能够结合在牙面上发挥抗菌效果。羟基磷灰石结合肽(hydroxyapatite binding peptides,habps)是一类能识别并结合于羟基磷灰石(hydroxyapatite，ha)材料表面的生物活性肽,多从天然蛋白中衍生。
3、而噬菌体展示技术(phage display technology)将外源性编码多肽或蛋白质的基因通过基因工程技术插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源多肽或蛋白呈现在噬菌体表面，然后，通过针对目标分子筛选噬菌体库，可分离出与目标结合的特异性噬菌体克隆，广泛应用于抗体筛选、酶工程、小分子多肽药物筛选
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于：为了解决上述技术问题，本专利技术提供磷灰石结合特性的七肽序列、淘选方法及其应用。
2、本专利技术为了实现上述目的具体采用以下技术方案：
3、本专利技术的第一个专利技术提供磷灰石结合特性的七肽序列(从n端至c端)，包括：
4、结构一，该七肽的氨基酸序列为：tyr-ser-leu-his-trp-gly-glu；
5、结构二，该七肽的氨基酸序列为：arg-thr-gly-thr-glu-leu-leu；
6、结构三，该七肽的氨基酸序列为：ser-val-ala-asn-ala-tyr-arg；
7、结构四，该七肽的氨基酸序列为：met-trp-pro-his-pro-leu-tyr。
8、本专利技术的第二个专利技术提供磷灰石结合特性的七肽序列的淘选方法，用于制备上述磷灰石结合特性的七肽序列，包括如下步骤：
9、s1、羟基磷灰石预处理和淘选：使用羟基磷灰石作为靶分子对随机m13噬菌体七肽肽库进行多轮筛选，获取了能与羟基磷灰石特异性结合的重组噬菌体，分离得到重组噬菌体的噬菌体蓝斑并制备单克隆噬菌体储液，提取单克隆噬菌体基因组进行序列测定，得到若干个非重复羟基磷灰石结合肽序列；
10、s2、荧光亲和力分析实验：通过免疫荧光技术进一步筛选，比较羟基磷灰石结合亲和力，最终得到四条对羟基磷灰石亲和力最高的羟基磷灰石结合肽的七肽序列。
11、在一个具体实施方式中，步骤s1的具体步骤如下：
12、s11、羟基磷灰石预处理；
13、s12、羟基磷灰石的六轮淘选：使用羟基磷灰石作为靶分子对随机m13噬菌体七肽肽库进行6轮淘选，获取了能与羟基磷灰石特异性结合的重组噬菌体，分离得到重组噬菌体的噬菌体蓝斑并制备单克隆噬菌体储液，提取单克隆噬菌体基因组进行序列测定，得到87个非重复羟基磷灰石结合肽序列；
14、单克隆噬菌体储液的制备和测序：
15、分别挑取第三轮淘选的20个噬菌蓝斑、第四轮淘选的20个噬菌蓝斑、第五轮淘选的23个噬菌蓝斑和第六轮淘选的24个噬菌蓝斑进行单克隆噬菌体储液的制备，并随机挑选4个原库蓝斑进行单克隆储液的制备，并送测序；
16、共获取包括4条原库对照肽和87条非重复羟基磷灰石结合肽序列，一共92条肽序列。
17、在一个具体实施方式中，步骤s11中，羟基磷灰石预处理具体步骤如下：
18、s111、取羟基磷灰石片，加入去离子水，超声震荡清洗；加入无水乙醇，超声震荡清洗；加入去离子水，超声震荡清洗；
19、s112、酸处理：配制盐酸溶液处理羟基磷灰石片，去离子水清洗至中性；
20、s113、碱处理：配制naoh溶液，热水浴处理羟基磷灰石片，去离子水清洗至中性；
21、s114、采用sem扫描电子显微镜对羟基磷灰石片样本表面形貌进行表征；
22、s115、取2块羟基磷灰石片在去离子水条件下用快机磨成粉末置于ep管，均匀搅拌下过筛，离心，轻轻吸去上清液，保留沉淀，加入适量去离子水，过滤清洗三次，加入适量去离子水，超声震荡清洗；加入无水乙醇，超声震荡清洗；加入去离子水，超声震荡清洗；
23、s116、烘干粉末后酸碱预处理，清洗至中性；
24、s117、采用傅里叶红外光谱仪对羟基磷灰石粉末的样本分子结构进行表征：取羟基磷灰石粉末，放置于傅里叶红外光谱仪样品台上进行检测；
25、s118、用纳米粒度电位仪进行zeta电位检测。
26、在一个具体实施方式中，步骤s12的具体步骤如下：
27、第一轮淘选的具体方式如下：
28、a、淘选底物预处理：取羟基磷灰石片，依次加入适量去离子水、无水乙醇以及去离子水，各超声震荡清洗后高温高压灭菌；放入孔板中，加入新鲜配置的tbst缓冲液，封口膜封闭后放入湿盒，室温摇动过夜；
29、b、使用tbst缓冲液清洗淘选所用器具；
30、c、吸去淘选羟基磷灰石片所在孔板的小孔的过夜孵育液；
31、d、加入tbst稀释后，使总的噬菌体投入量为2×1011pfu，封口膜封闭孔板后放入无菌湿盒，置于摇床摇动；
32、e、吸去孔板的小孔内未结合噬菌体，用新鲜配置的tbst缓冲液孔板以去除残余未结合噬菌体，每次应吸净小孔内液体但应避免小孔完全干燥，收集洗脱液，备测量洗脱液的滴度以评价洗脱效率；
33、f、使用结合噬菌体的羟基磷灰石片进行噬菌体扩增。
34、在一个具体实施方式中，使用结合噬菌体的羟基磷灰石片进行噬菌体扩增，具体方式如下：
35、a、于灭菌处理的三角瓶中加入lb液体培养基和四环素储液，将宿主菌的过夜培养物稀释于上述溶液中，将附着噬菌体的羟基磷灰石片加入感染细菌并培养；
36、b、将含有扩增后噬菌体的培养液转入灭菌处理的高速离心管，将羟基磷灰石片移至ep管，加入lb液体培养基，和培养液一起离心，将上清液转入新鲜的灭菌高速离心管再次离心以进本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.磷灰石结合特性的七肽序列，其特征在于，包括：
2.一种磷灰石结合特性的七肽序列的淘选方法，用于制备权利要求1所述的磷灰石结合特性的七肽序列，其特征在于，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种磷灰石结合特性的七肽序列的淘选方法，其特征在于，步骤S1的具体步骤如下：
4.根据权利要求3所述的一种磷灰石结合特性的七肽序列的淘选方法，其特征在于，步骤S11的具体步骤如下：
5.根据权利要求3所述的一种磷灰石结合特性的七肽序列的淘选方法，其特征在于，步骤S12的具体步骤如下：
6.根据权利要求5所述的一种磷灰石结合特性的七肽序列的淘选方法，其特征在于，使用结合噬菌体的羟基磷灰石片进行噬菌体扩增，具体方式如下：
7.根据权利要求6所述的一种磷灰石结合特性的七肽序列的淘选方法，其特征在于，羟基磷灰石片的第二轮至第六轮淘选的具体方式如下：
8.根据权利要求7所述的一种磷灰石结合特性的七肽序列的淘选方法，其特征在于，步骤S2中，荧光亲和力分析实验具体步骤如下：
9.一种磷灰石结合特性的七肽序列
...【技术特征摘要】
1.磷灰石结合特性的七肽序列，其特征在于，包括：
2.一种磷灰石结合特性的七肽序列的淘选方法，用于制备权利要求1所述的磷灰石结合特性的七肽序列，其特征在于，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种磷灰石结合特性的七肽序列的淘选方法，其特征在于，步骤s1的具体步骤如下：
4.根据权利要求3所述的一种磷灰石结合特性的七肽序列的淘选方法，其特征在于，步骤s11的具体步骤如下：
5.根据权利要求3所述的一种磷灰石结合特性的七肽序列的淘选方法，其特征在于，步骤s12的具体步骤如下：
6.根据权利要求5所...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨焰，马净植，胡佩，魏蔚，曾凯，李瑛傑，胡靖宇，陈彬文，吕逢源，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属同济医院，
类型：发明
国别省市：
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