【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及奶牛的非入侵方法鉴定产奶的类型，特别是指基于csn3 3′utr多态性鉴别牛奶κ-酪蛋白a、b型的方法。
技术介绍
1、牛乳中含有大量的蛋白质，酪蛋白约占牛乳总蛋白的80％，而κ-酪蛋白(kappa-casein，k-cn)在总酪蛋白中约占12％，是最重要的酪蛋白之一，也是凝乳酶的天然底物。k-cn是牛乳腺分泌的一种含有少量磷酸基的磷蛋白之一，影响着牛乳中酪蛋白微胶粒的稳定性以及产奶量、乳脂、乳蛋白等相关性状，同时在奶酪生产过程中对凝集时间和奶酪的软硬度也起到重要的作用。
2、近年来，分子生物检测技术已经广泛应用于牛乳蛋白多态性研究，主要方法有pcr-sscp、pcr-rflp、taqman、质谱法、直接测序、hrm、snapshot、gbs、基因芯片、等位基因特异pcr和液相芯片等，但以上方法存在检测过程繁琐、通量低或者检测成本较高的问题。现有的研究中赵凤等针对荷斯坦牛κ-酪蛋白基因中3个遗传变异体，将在aa、bb、ee、ab、ae、be六种基因型。牛κ-酪蛋白a和b是最常见的基因型(pinders等，1991)。在大多数欧洲品种中，κ-cn的a突变比b突变更频繁，而e是最不频繁的(lien等，1999；van&medrano，1991)。a型牛奶相比较，发现b型与凝乳时间较短有关，而使用bb基因型奶牛产的牛奶形成的奶酪与ab型相比具有更高的产量、更高的蛋白质含量和更好的质量(lundén等，1997；martin等，2002)。在热稳定性方面，κ-酪蛋白b型提高了牛奶在自然ph下的
3、现在检测κ-酪蛋白a和b型的方法主要为pcr-rflp和液相色谱法。pcr-rflp方法的缺点是需要采集牛的血液作为检测样本，另外，这个方法除了提取dna，扩增片段外，还要进行酶切，跑page胶，操作比较繁琐，花费时间较多，采集样品对动物有一定的刺激。液相色谱法需要大型仪器，且需要购买牛κ-酪蛋白的标准品，目前sigma公司在售的κ-酪蛋白标准品的纯度只达到70％，这样使得检测结果存在一定的不准确性。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提出一种基于csn3 3′utr多态性鉴别牛奶κ-酪蛋白a、b型的方法，通过非侵入法检测奶牛产牛奶的表型。
2、本专利技术的技术方案是这样实现的：
3、基于csn3 3′utr多态性鉴别牛奶κ-酪蛋白a、b型的方法，通过csn3-3’utr的突变碱基个数来判断奶牛csn3的基因型。
4、进一步的，csn3-3’utr全长中碱基突变个数＜3的csn3基因型的奶牛产的牛奶为b型牛奶，csn3-3’utr全长中突变碱基个数在3-9之间的csn3基因型的奶牛产的牛奶为a型牛奶。
5、进一步的，上述b型牛奶对应的奶牛csn3为bb型或ab型；a型牛奶对应的奶牛csn3为aa型或ab型。
6、具体来说，步骤为：
7、(1)从待测牛奶样品中离心获得体细胞，对体细胞提取rna、反转录获得cdna；
8、(2)以待测牛奶的cdna为模板，以csn3-3’utr的引物对进行pcr扩增；
9、(3)回收pcr扩增产物经连接、转化测序获得待测牛奶的csn3-3’utr全长；
10、(4)将获得的待测牛奶的csn3-3’utr全长与b型κ-酪蛋白对应的碱基序列进行比对，分析待测牛奶对应的csn3 3’-utr的突变位点个数，根据突变位点的数量判断待测牛奶的κ-酪蛋白是a型牛奶还是b型牛奶。
11、上述步骤(2)中csn3-3’utr的引物对为csn3-e-3′utr-f序列如seq id no.1所示和csn3-e-3′utr-r序列如seq id no.2所示。
12、上述pcr扩增的条件为：预变性94℃2min；接着变性94℃30sec，退火50℃30sec，延伸72℃30sec，共30个循环；然后是延伸72℃2min。
13、上述步骤(4)中b型κ-酪蛋白的碱基序列如seq id no.3所示。
14、上述待测牛奶的csn3的基因型包括b型牛奶和a型牛奶，其中b型牛奶的csn3-3’utr全长中突变位点的数量≤3；a型牛奶的csn3-3’utr全长中突变位点的数量在3-9之间。
15、一种筛选产b型牛奶的奶牛的方法，步骤为：利用上述的方法，筛选待测牛奶的csn3的基因型为b型牛奶所对应的奶牛。
16、上述b型牛奶的csn3-3’utr全长中突变位点的数量≤3。
17、本专利技术具有以下有益效果：
18、1、本申请过扩增csn3 3’utr的全长和ensemble数据库的csn3转录本(ensbtat00000028685.5)比较，通过碱基突变的个数就可以确定a、b型牛奶和csn3的大概基因型。0突变和3个以下碱基突变的都是b型奶，对应奶牛csn3为bb型或ab型，3个以上碱基突变的都是a型奶，对应奶牛csn3为aa型或ab型。本申请的方法所需要的样本量少，采用从牛奶中获取的体细胞即可进行，不会对牛造成伤害，且后期不需要再进行酶切分析等手段，方法简单，适合在奶牛养殖中大范围应用。
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1. 基于CSN3 3'UTR多态性鉴别牛奶κ-酪蛋白A、B型的方法，其特征在于：通过CSN3-3’UTR的突变碱基个数来判断奶牛CSN3的基因型。
2.根据权利要求1所述的鉴别牛奶κ-酪蛋白A、B型的方法，其特征在于：CSN3-3’UTR全长中碱基突变个数≤3的CSN3基因型的奶牛产的牛奶为B型牛奶，CSN3-3’UTR全长中突变碱基个数在3-9之间的CSN3基因型的奶牛产的牛奶为A型牛奶。
3.根据权利要求1所述的鉴别牛奶κ-酪蛋白A、B型的方法，其特征在于：所述B型牛奶对应的奶牛CSN3为BB型或AB型；A型牛奶对应的奶牛CSN3为AA型或AB型。
4.根据权利要求3所述的鉴别牛奶κ-酪蛋白A、B型的方法，其特征在于，步骤为：
5. 根据权利要求4所述的鉴别牛奶κ-酪蛋白A、B型的方法，其特征在于：所述步骤（2）中CSN3-3’UTR的引物对为CSN3-E-3'UTR-F序列如SEQ ID No.1所示和CSN3-E-3'UTR-R序列如SEQ ID No.2所示。
6. 根据权利要求5所述的鉴别牛奶κ-酪蛋白A、
7. 根据权利要求6所述的鉴别牛奶κ-酪蛋白A、B型的方法，其特征在于：所述步骤（4）中B型κ-酪蛋白的碱基序列如SEQ ID No.3所示。
8.根据权利要求7所述的鉴别牛奶κ-酪蛋白A、B型的方法，其特征在于：所述待测牛奶的CSN3的基因型包括B型牛奶和A型牛奶，其中B型牛奶的CSN3-3’UTR全长中突变位点的数量≤3；A型牛奶的CSN3-3’UTR全长中突变位点的数量在3-9之间。
9.一种筛选产B型牛奶的奶牛的方法，其特征在于：利用权利要求4-8任一项所述的方法，筛选待测牛奶的CSN3的基因型为B型牛奶所对应的奶牛。
10.根据权利要求9所述的筛选产B型牛奶的奶牛的方法，其特征在于：所述B型牛奶的CSN3-3’UTR全长中突变位点的数量≤3。
...【技术特征摘要】
1. 基于csn3 3'utr多态性鉴别牛奶κ-酪蛋白a、b型的方法，其特征在于：通过csn3-3’utr的突变碱基个数来判断奶牛csn3的基因型。
2.根据权利要求1所述的鉴别牛奶κ-酪蛋白a、b型的方法，其特征在于：csn3-3’utr全长中碱基突变个数≤3的csn3基因型的奶牛产的牛奶为b型牛奶，csn3-3’utr全长中突变碱基个数在3-9之间的csn3基因型的奶牛产的牛奶为a型牛奶。
3.根据权利要求1所述的鉴别牛奶κ-酪蛋白a、b型的方法，其特征在于：所述b型牛奶对应的奶牛csn3为bb型或ab型；a型牛奶对应的奶牛csn3为aa型或ab型。
4.根据权利要求3所述的鉴别牛奶κ-酪蛋白a、b型的方法，其特征在于，步骤为：
5. 根据权利要求4所述的鉴别牛奶κ-酪蛋白a、b型的方法，其特征在于：所述步骤（2）中csn3-3’utr的引物对为csn3-e-3'utr-f序列如seq id no.1所示和csn3-e-3'utr-r序列如seq id no.2所示。
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【专利技术属性】
技术研发人员：李文清，张立阳，王潇阳，苏全友，孙凯珍，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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