【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于昆虫生殖领域，具体涉及一种分离鳞翅目昆虫有核精子和无核精子的方法。
技术介绍
1、鳞翅目昆虫的生命活动与人类经济和社会发展息息相关。一方面，以家蚕为代表的部分鳞翅目昆虫是极具经济价值的昆虫；另一方面，大部分鳞翅目，比如小菜蛾、草地贪夜蛾、玉米螟等，会对栽培作物造成危害，导致巨大的经济损失。据统计，我国已知的鳞翅目害虫约有8000种。因此，专利技术针对鳞翅目昆虫生殖系统的药物或采用生物技术进行绿色防治，已成为当前的热点研究之一。
2、除小翅蛾科外，其余鳞翅目昆虫都具有精子二型性，即它们产生两种类型的精子：一种是不具备授精能力的无核精子(apyrene sperm)，另一种是能与卵子结合的有核精子(eupyrene sperm)。这两种精子都是由具有相同基因组的精原细胞分化而来的。鳞翅目昆虫要保证高效的生殖能力，必须同时具有健康的有核精子和无核精子。无核精子作为鳞翅目昆虫特有的精子类型，为防治鳞翅目害虫提供了新的靶标。然而，关于鳞翅目昆虫如何产生这两种精子的机制仍不清晰，为深入研究这两种精子的产生机制及功能特化，我们需要将这两种精子进行分离。
3、1992年，minoru osanai、梁振中等人通过percoll密度梯度离心法对家蚕有核精子和无核精子进行分离，该方法较为复杂且分离得到的精子活力差，因此未得到推广。2015年，timothy l.karr等人通过水平旋转淘洗法对美洲帝王蝶储精囊中的有核精子和无核精子进行分离。然而，当该方法应用于家蚕时，由于家蚕储精囊中的无核精子处于单细胞状态，它
4、因此，亟需探索专利技术一种能够在鳞翅目昆虫中普遍应用，且有效分离有核精子和无核精子并保证其活性的方法，为下游的相关的基础研究提供技术保证。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于解决现有技术中的不足，并提供一种分离鳞翅目昆虫有核精子和无核精子的方法，该方法能够高效分离有核精子和无核精子，并且保证其活性。
2、本专利技术所采用的具体技术方案如下：
3、本专利技术提供了一种分离鳞翅目昆虫有核精子和无核精子的方法，具体步骤如下：
4、s1：按顺序组装灭菌后的移液枪枪头、第一乳胶管、滤菌膜、第二乳胶管、注射器针筒；在注射器针筒的另一端设置带孔的软塞，并在软塞中插入毛细玻璃针，完成口吸器的组装；
5、s2：解剖获得鳞翅目昆虫的精巢室，在含有完全培养基的培养皿上释放含有生殖细胞的精液；所述完全培养基为含有10％胎牛血清的tc-100昆虫培养基；
6、s3：在体视显微镜下，采用所述口吸器对培养皿上的有核精子束和无核精子束进行区分：将毛细玻璃针对准培养皿上的有核精子束，从移液枪枪头端吸气，将有核精子束吸入毛细玻璃针内，随后将毛细玻璃针(7)内的有核精子束转移至其他容器中，重复操作直至培养皿上的有核精子束全部转移；随后更换口吸器上的毛细玻璃针，将毛细玻璃针对准培养皿上的无核精子束，重复上述操作，直至培养皿的无核精子束全部转移。
7、作为优选，所述移液枪枪头内塞有避免口水流入口吸管内部的脱脂棉。
8、作为优选，所述移液枪枪头的规格为200μl。
9、作为优选，所述注射器针筒的规格为1ml。
10、作为优选，所述毛细玻璃针的直径为1mm。
11、作为优选，所述滤菌膜采用0.22μm或0.45μm的滤膜。
12、作为优选，所述精巢室的解剖过程具体如下：解剖鳞翅目昆虫后，去除精巢周边的脂肪体、气管组织以及输精管，只取其精巢室；将精巢室置于4℃、ph值为7.3的无菌磷酸缓冲盐溶液中，备用。
13、作为优选，所述tc-100昆虫培养基包括：1.0g/l葡萄糖，0.6g/l l-谷氨酰胺，0.35g/l nahco3。
14、作为优选，所述有核精子束呈细长型；长度范围为500～700μm。
15、作为优选，所述无核精子束呈短粗的梭型，长度范围为150～300μm。
16、本专利技术相对于现有技术而言，具有以下有益效果：
17、(1)本专利技术提供的分离方法克服了percoll密度梯度离心法和水平旋转离心法在分离蚕蛾精子时精子活性不高的问题，并且该方法具有操作简单、便捷的优势。相对于双层分子筛分离法，本专利技术提供的方法分离得到的有核精子和无核精子纯度更高，避免了精原细胞和精母细胞的污染问题。
18、(2)使用本专利技术提供的分离方可快速吸取多个精子束，由于每个精子束约包含250个精子，因此吸取一个精子束相当于取了250个精子，具有高效性。经本专利技术方法分离的有核精子和无核精子纯度极高(如图2显示)，且分离过程对精子损伤小，分离后的精子保存于完全培养基中，活性高。通过本专利技术分离后的精子可用于培养、核酸抽提等下游步骤，满足多种需求。
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1.一种分离鳞翅目昆虫有核精子和无核精子的方法，其特征在于，具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的分离鳞翅目昆虫有核精子和无核精子的方法，其特征在于，所述移液枪枪头(1)内塞有避免口水流入口吸管内部的脱脂棉。
3.根据权利要求1所述的分离鳞翅目昆虫有核精子和无核精子的方法，其特征在于，所述移液枪枪头(1)的规格为200μL。
4.根据权利要求1所述的分离鳞翅目昆虫有核精子和无核精子的方法，其特征在于，所述注射器针筒(5)的规格为1mL。
5.根据权利要求1所述的分离鳞翅目昆虫有核精子和无核精子的方法，其特征在于，所述毛细玻璃针(7)的直径为1mm。
6.根据权利要求1所述的分离鳞翅目昆虫有核精子和无核精子的方法，其特征在于，所述滤菌膜(3)采用0.22μm或0.45μm的滤膜。
7.根据权利要求1所述的分离鳞翅目昆虫有核精子和无核精子的方法，其特征在于，所述精巢室的解剖过程具体如下：解剖鳞翅目昆虫后，去除精巢周边的脂肪体、气管组织以及输精管，只取其精巢室；将精巢室置于4℃、pH值为7.3的无菌磷酸缓冲盐溶液
8.根据权利要求1所述的分离鳞翅目昆虫有核精子和无核精子的方法，其特征在于，所述TC-100昆虫培养基包括：1.0g/L葡萄糖，0.6g/L L-谷氨酰胺，0.35g/L NaHCO3。
9.根据权利要求1所述的分离鳞翅目昆虫有核精子和无核精子的方法，其特征在于，所述有核精子束呈细长型；长度范围为500～700μm。
10.根据权利要求1所述的分离鳞翅目昆虫有核精子和无核精子的方法，其特征在于，所述无核精子束呈短粗的梭型，长度范围为150-300μm。
...【技术特征摘要】
1.一种分离鳞翅目昆虫有核精子和无核精子的方法，其特征在于，具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的分离鳞翅目昆虫有核精子和无核精子的方法，其特征在于，所述移液枪枪头(1)内塞有避免口水流入口吸管内部的脱脂棉。
3.根据权利要求1所述的分离鳞翅目昆虫有核精子和无核精子的方法，其特征在于，所述移液枪枪头(1)的规格为200μl。
4.根据权利要求1所述的分离鳞翅目昆虫有核精子和无核精子的方法，其特征在于，所述注射器针筒(5)的规格为1ml。
5.根据权利要求1所述的分离鳞翅目昆虫有核精子和无核精子的方法，其特征在于，所述毛细玻璃针(7)的直径为1mm。
6.根据权利要求1所述的分离鳞翅目昆虫有核精子和无核精子的方法，其特征在于，所述滤菌膜(3)采用0.22μm或0.45μm的滤膜。<...
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