【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及rna建库领域，具体而言，涉及一种小rna的建库方法。
技术介绍
1、大多数人类rna都与癌症相关，抑癌基因rnas的过度表达或抑癌基因rnas的抑制可通过抑制细胞凋亡、细胞增殖、上皮间质转化(emt)和转移等途径导致肿瘤生长。随着一些ccfrnas不可降解特性的发现，rnas作为肿瘤生物标志物的潜力变得越来越重要。
2、与组织活检相比，无细胞rna(cfrna)测序具有一些明显的优势。首先，与肿瘤活组织检查相比，无论哪个部位，采集外周血获得的cfrna都是微创。其次，其可以在治疗过程中的任何时候采集血液，从而实时和动态地监测肿瘤中的分子变化，而不是依赖于侵袭性活检甚至成像的挑战。此外，对cfrna的监测可能会检测到不明显或在成像时不确定的肿瘤(例如残余肿瘤切除后)。因此，cfrna能够对肿瘤的早期诊断、放化疗药物的疗效评估、肿瘤负荷和进展监测提供可靠的信息，具有无创、实时检测和早于影像学检查结果等优点，在肿瘤诊断、疗效监测和预后评估方面具有价值。
3、然而，现有的血浆cfrna建库主要使用一些mirna建库方案，通常使用t4 rna连接酶1或者t4 rna连接酶2连接3′端或是5′端的接头，由于连接之前需要先通过酶反应使rna产生poly(a)尾巴，然后再用连接酶与poly(t)的接头连接，这样虽然聚腺苷酸化的rna和oligo dt的接头连接效率比单纯的单链连接效率高，但是磷酸化处理后的rna会产生自连，聚腺苷酸化对于3′端2′-o-甲基修饰的srna(即small rna)敏感，而且腺
4、因此，急需开发一种新的cfrna的建库方案，以改善在3′端small rna和mrna接头连接中存在的连接偏差的问题。
技术实现思路
1、本专利技术的主要目的在于提供一种小rna的建库方法，以解决现有技术中此类建库方法存在接头连接偏差的问题。
2、为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种小rna文库的构建方法，该构建方法包括：对小rna进行3′接头连接，得到3′接头连接产物；采用过量mlv反转录酶对3′接头连接产物进行反转录，得到反转录产物；对反转录产物进行pcr扩增，得到小rna文库。
3、进一步地，小rna为血浆游离rna，采用5′端磷酸腺苷化的3′接头与血浆游离rna的3′-oh连接，得到3′接头连接产物；优选地，采用截短型的t4 rnl2trt4 rna连接酶ii特异性催化5′端磷酸腺苷化的3′接头与血浆游离rna的3′-oh连接，得到3′接头连接产物。
4、进一步地，在得到3′接头连接产物之后，以及进行反转录之前，构建方法还包括：去除3′接头连接产物中过量的3′接头；优选地，将3′接头连接产物与含有反转录引物、5′脱腺苷酶及λ外切核酸酶的接头消化体系混合，从而去除3′接头连接产物中过量的3′接头。
5、进一步地，采用过量mlv反转录酶对3′接头连接产物进行反转录，得到反转录产物包括：在反转录引物的引发下，采用过量的mlv反转录酶，对含有3′接头连接产物和5′接头的体系进行反转录扩增，得到含有5′接头的反转录产物；其中，当过量的mlv反转录酶反转录至3′接头连接产物的末端时，在反转录的cdna第一链的末端额外增加2-5个c，利用额外增加的2-5个c与5′接头互补的关系，继续对5′接头进行反转录，从而获得含有5′接头的反转录产物。
6、进一步地，对反转录产物进行pcr扩增，得到小rna文库包括：采用文库扩增引物对反转录产物进行pcr扩增，得到双链扩增产物；对双链扩增产物进行变性，得到变性产物；对变性产物进行特异性单链环化，得到单链环化产物；对单链环化产物进行片段化文库构建，得到小rna文库。
7、进一步地，对单链环化产物进行文库构建之前，构建方法还包括对单链环化产物先进行纯化的步骤，优选地，纯化的步骤包括：对单链环化产物进行酶切消化，得到消化产物；对消化产物进行纯化，得到纯化后的单链环化产物。
8、进一步地，反转录的反应体系中，除了过量的mlv反转录酶外，还包括甜菜碱和/或dtt；优选地，甜菜碱的用量以mlv反转录酶的活力单位计，为0.1mm/u～1mm/u；优选地，dtt的用量以mlv反转录酶的活力单位计，为0.01mm/u～1mm/u；优选地，mlv-rt反转录酶与3′接头连接产物的用量比为5u/μl～8u/μl。
9、进一步地，在对小rna进行3′接头连接之前，构建方法还包括：获取小rna；优选地，获取小rna包括：从样品中分离提取总rna；从总rna中去除rrna，获得小rna；更优选地，从总rna中去除rrna，获得小rna包括：采用rrna的dna探针与总rna进行杂交，得到dna-rna杂交复合物；采用rnase h消化dna-rna杂交复合物中的rna，得到rrna消化产物；采用dnase i消化rrna消化产物中的dna探针，得到dna消化产物；对dna消化产物进行纯化，得到小rna。
10、进一步地，小rna为cfrna，优选地，cfrna为血浆cfrna、尿液cfrna或脑脊液cfrna。
11、进一步地，对变性产物进行特异性单链环化，得到单链环化产物包括：在环化辅助序列和连接酶的作用下将变性产物中的一条单链连接成环，得到连接产物；对连接产物进行酶切以消化未连接成环的变性产物，得到单链环化产物；其中，环化辅助序列与变性产物两端的序列互补。
12、应用本专利技术的技术方案，通过采用过量mlv反转录酶对连接了3′接头的连接产物进行反转录，过量的逆转录酶对rna模板中的2′-o-甲基修饰的敏感性低，且mlv反转录酶会不依赖模板在cdna的3′端生成2-5个c，延长的c可以和5′端接头互补，继续反转录即可获得带有5′接头的反转录产物，不仅省略了反转录前5′接头连接的步骤，而且还能避免常规5′接头连接的偏差，此外还能降低rna自连现象，提高反转录效率。
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1.一种小RNA文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述小RNA为血浆游离RNA，采用5′端磷酸腺苷化的3′接头与所述血浆游离RNA的3′-OH连接，得到所述3′接头连接产物；
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在得到所述3′接头连接产物之后，以及进行所述反转录之前，所述构建方法还包括：去除所述3′接头连接产物中过量的3′接头；
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，采用过量MLV反转录酶对所述3′接头连接产物进行反转录，得到反转录产物包括：
5.根据权利要求1至4中任一项所述的构建方法，其特征在于，对所述反转录产物进行PCR扩增，得到所述小RNA文库包括：
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，对所述单链环化产物进行文库构建之前，所述构建方法还包括对所述单链环化产物先进行纯化的步骤，
7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述反转录的反应体系中，除了过量的所述MLV反转录酶外，还包括甜菜碱和/或DTT；
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