【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及水稻基因工程，具体涉及一种通过抑制mlo12基因表达防止转基因花粉漂移的方法。
技术介绍
1、转基因植物种类和种植面积迅猛增加，转基因作物的大规模环境释放及其可能带来的环境生物安全问题己经日益成为目前全球最受关注和争议的领域之一。转基因植物中的外源基因通过花粉逃逸转移到环境中的非转基因品种或其野生近缘种(包括杂草种类)中，并通过遗传渐渗在野生近缘种的群体中保留或进一步扩散，从而带来环境生物安全问题。虽然转基因生物对生物多样性或生态平衡有上述这些可能的负面影响。但是，并不是说大量使用转基因生物一定就会破坏生物多样性或生态平衡。关键如何对其使用进行严格的审批和有效的监管，并通过行之有效的技术手段把负面影响降至最低。
2、目前己经发现一些降低花粉中外源基因扩散的方法，常见的如叶绿体转化、含外源基因花粉的致死效应等。在防止转基因花粉漂移的应用中，spt技术利用花粉特异性启动子驱动玉米的α淀粉酶基因在含有转基因元件的花粉中高水平表达，通过该淀粉酶降解转基因花粉中的淀粉，使转基因花粉发育因缺乏所需的能量而败育，从而避免因转基因花粉逃逸所产生的转基因生物安全问题(wu et al,2016)。
3、mlo12编码一个七跨膜结构域蛋白，它含有一个n端胞外区和一个c端胞质区，c端区域介导钙依赖性的与钙调素的相互作用。mlo12在成熟的花粉粒中特异表达并调控水稻花粉的水合作用，突变体由于水合作用失败，成熟花粉粒在体内或体外均不能正常萌发(jakyung yi et al,2014)。目前，已经在水稻中有多种雄配
技术实现思路
1、本专利技术提供一种通过抑制mlo12基因表达防止转基因花粉漂移的方法。
2、第一方面，本专利技术提供mlo12基因在抑制花粉管伸长防止转基因花粉逃逸中的应用。
3、在本专利技术所提供的应用中，在mlo12基因中引入一个或多个核苷酸的缺失、插入或取代；或通过反义基因的转入、共抑制或发夹结构的引入抑制mlo12基因的表达，从而防止水稻外源基因从转基因水稻中漂移。
4、在本专利技术所提供的应用中，构建mlo12基因的rnai植物表达载体，抑制mlo12基因的表达。
5、第二方面，本专利技术提供一种rnai植物表达载体，所述rnai植物表达载体为发卡结构表达盒，所述发卡结构表达盒含有由seq idno.1和seq id no.3所示的茎及seq id no.2所示的环形成的发卡结构。
6、本专利技术所提供的rnai植物表达载体中，启动子可以是组织特异性启动子或组成型启动子，优选的，本专利技术所选启动子为植物组成型启动子ubiqutin，启动子的核苷酸序列如seq id no.4所示；nos终止子的核苷酸序列如seq id n0.5所示。
7、第三方面，本专利技术提供含有上分述的rnai植物表达载体的重组载体，所述重组载体中，rnai植物表达载体串联一个转基因种子逃逸筛选表达盒，所述转基因种子逃逸筛选表达盒为fp635，所述重组载体为pbwa(v)hu-mlo12i-fp635；
8、优选地，所述fp635的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述转基因种子逃逸筛选表达盒中，组织特异性启动子含有信号肽和种子特异性启动子，所述种子特异性启动子zz1的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述信号肽的核苷酸序列如seq id no.8所示。
9、其中，所述的深红色荧光蛋白fp635能在560-595nm激发光下，含有载体的转基因种子能够激发红色荧光，不含载体的非转基因种子不发荧光，从而达到转基因种子筛选的目的。
10、将所述深红色荧光蛋白基因和rnai植物表达载体紧密串联得到重组载体pbwa(v)hu-mlo12i-fp635，然后利用野生型水稻品种中花11幼胚或成熟胚诱导的愈伤组织作为转化外植体，利用农杆菌介导的转化方法将外源基因导入；受体细胞在共培养后的30天内利用荧光显微镜进行三次筛选，将稳定表达红色荧光的愈伤组织分化成幼苗；对转化幼苗进一步进行分子生物学鉴定和花粉活性鉴定。
11、本专利技术的rnai植物表达载体可通过农杆菌介导遗传转化法、基因枪法、花粉管通道法等常规生物学方法转化植物细胞或组织。
12、第四方面，本专利技术提供一种防止转基因花粉逃逸的方法，包括：将所述重组载体pbwa(v)hu-mlo12i-fp635导入野生型水稻愈伤组织中获得转基因花粉败育的水稻植株。
13、在本专利技术所提供的防止转基因花粉逃逸的方法，所述重组载体pbwa(v)hu-mlo12i-fp635与淀粉酶表达抑制载体联合，抑制转基因花粉逃逸。
14、第五方面，本专利技术提上述的rnai植物表达载体或上述的重组载体制备转基因花粉败育植株中的应用。
15、第六方面，本专利技术提供防止基因漂移的水稻工程保持系在水稻育种中的应用，所述水稻工程保持系上述的rnai植物表达载体或上述的重组载体，或所述水稻工程保持系由上述方法制备得到。
16、本专利技术的有益效果在于：
17、(1)本专利技术提供的是一种通过抑制花粉管伸长来抑制转基因花粉逃逸的方法，本专利技术提供的是一个全新的花粉败育方法。
18、(2)本专利技术选择抑制mlo12基因表达，对mlo12基因进行干扰后，不影响其他组织部位的功能。如果干扰的植株为纯合子则为不育植株；如果为杂合子则为可育植株，但可育植株中的花粉只有一半功能正常，另一半不育的花粉含有转基因元件。
19、(3)本专利技术所提供的花粉败育方法，与淀粉酶水解淀粉导致转基因花粉败育的作用时期、机制不同，此方法可以独立或联合应用，进一步提高植物转基因花粉败育效果；
20、(4)本专利技术所构建的mlo12基因rnai表达载体无外源基因/蛋白表达，增加了转基因安全性。
21、(5)本专利技术构建了pbwa(v)hu-mlo12i-fp635表达载体不仅能够防止转基因花粉逃逸，还能通过荧光机械筛选防止转基因种子逃逸。花粉-种子双重防止逃逸保证了转基因逃逸的风险。
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1.MLO12基因在抑制花粉管伸长防止转基因花粉逃逸中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在MLO12基因中引入一个或多个核苷酸的缺失、插入或取代；或通过反义基因的转入、共抑制或发夹结构的引入抑制MLO12基因的表达，从而防止水稻外源基因从转基因水稻中漂移。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，构建MLO12基因的RNAi植物表达载体，抑制MLO12基因的表达。
4.一种RNAi植物表达载体，其特征在于，所述RNAi植物表达载体为发卡结构表达盒，所述发卡结构表达盒含有由SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示的茎及SEQ ID No.2所示的环形成的发卡结构。
5.根据权利要求4所述的RNAi植物表达载体，其特征在于，所述RNAi植物表达载体中，启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；NOS终止子的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
6.含有权利要求4-5任一项所述的RNAi植物表达载体的重组载体，其特征在于，所述重组载体中，RNAi植物表达载体串联一个转基因种子逃逸筛选表达
7.一种防止转基因花粉逃逸的方法，其特征在于，包括：将所述重组载体pBWA(V)HU-MLO12i-FP635导入野生型水稻愈伤组织中获得转基因花粉败育的水稻植株。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述重组载体pBWA(V)HU-MLO12i-FP635与淀粉酶表达抑制载体联合，抑制转基因花粉逃逸。
9.权利要求4-5任一项所述的RNAi植物表达载体或权利要求6所述的重组载体制备转基因花粉败育植株中的应用。
10.防止基因漂移的水稻工程保持系在水稻育种中的应用，其特征在于，所述水稻工程保持系含有权利要求4-5任一项所述的RNAi植物表达载体或权利要求6所述的重组载体，或所述水稻工程保持系由权利要求7-8任一项所述方法制备得到。
...【技术特征摘要】
1.mlo12基因在抑制花粉管伸长防止转基因花粉逃逸中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在mlo12基因中引入一个或多个核苷酸的缺失、插入或取代；或通过反义基因的转入、共抑制或发夹结构的引入抑制mlo12基因的表达，从而防止水稻外源基因从转基因水稻中漂移。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，构建mlo12基因的rnai植物表达载体，抑制mlo12基因的表达。
4.一种rnai植物表达载体，其特征在于，所述rnai植物表达载体为发卡结构表达盒，所述发卡结构表达盒含有由seq id no.1和seq id no.3所示的茎及seq id no.2所示的环形成的发卡结构。
5.根据权利要求4所述的rnai植物表达载体，其特征在于，所述rnai植物表达载体中，启动子的核苷酸序列如seq id no.4所示；nos终止子的核苷酸序列如seq id no.5所示。
6.含有权利要求4-5任一项所述的rnai植物表...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐杰，李新鹏，韩晓斌，刘昊，吴春瑜，曾翔，吴永忠，黄培劲，
申请(专利权)人：海南波莲科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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