【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，具体涉及构建l-缬氨酸生产菌株的方法、l-缬氨酸生产菌株及其应用。
技术介绍
1、l-缬氨酸是一种支链氨基酸(branched-chain amino acids，bcaas)，广泛应用于食品、医药和化妆品等行业(wu g et al.,amino acids,2009,37:1-17)。此外，l-缬氨酸可以提高饲养动物哺乳期的泌乳功能并增强动物的免疫力，也被应用于饲料行业(park y etal.,molecules,2016,21:1272；park j h et al.,proc natl acad sci u s a,2007,104:7797-7802)。l-缬氨酸可利用离子交换技术，从经亚临界水处理的肉类加工废弃物水解液中直接获取(zhu g et al.,j anal appl pyrol,2010,88:187-191)，该工艺成本高、效率低、反应复杂且难以控制。因此通过微生物发酵技术实现l-缬氨酸的高效生产受到研究者关注。
2、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)和大肠杆菌(escherichia coli)是目前发酵法生产l-缬氨酸的主要菌株(hasegawa s et al.,appl environ microbiol,2012,78:865-875；mustafi n et al.,plos one,2014,9:e85731；park j h et al.,biotechnol bioeng,2011,108:1140-1147；ha
技术实现思路
1、针对现有技术中的不足，本专利技术的目的是提供一种构建l-缬氨酸生产菌株的方法、l-缬氨酸生产菌株及其应用。
2、为达到上述目的，本专利技术的解决方案是：
3、(1)一种构建l-缬氨酸生产菌株的方法，其特征在于，以2,3-丁二醇或乙偶姻生产菌株为出发菌株，对所述菌株进行基因工程改造以提高其l-缬氨酸产量。
4、(2)根据(1)所述的方法，其中对所述菌株进行以下改造：1)增加α-乙酰乳酸的合成；2)引入外源l-缬氨酸生物合成途径。
5、(3)根据(1)所述的方法，其中所述出发菌株选自克雷伯氏菌属、肠杆菌属、芽孢杆菌属、棒杆菌属和弧菌属微生物。
6、(4)根据(3)所述的方法，其中所述出发菌株选自产酸克雷伯氏菌(klebsiellaoxytoca)、阴沟肠杆菌(enterobacter cloacae)、大肠杆菌(escherichia coli)、需钠弧菌(vibrio natriegens)、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)和地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)。
7、(5)根据(2)所述的方法，其中所述增加α-乙酰乳酸的合成包括：i)抑制乙偶姻和/或2,3-丁二醇的合成；和/或ii)抑制乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸和/或乳酸的合成。
8、(6)根据(5)所述的方法，其中所述抑制乙偶姻和/或2,3-丁二醇的合成包括，敲除或敲减所述出发菌株中的以下一个或多个编码基因：α-乙酰乳酸脱羧酶编码基因buda、2,3-丁二醇脱氢酶编码基因budc和甘油脱氢酶编码基因glda。
9、(7)根据(5)所述的方法，其中所述抑制乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸和/或乳酸的合成包括，敲除或敲减所述出发菌株中的以下一个或多个编码基因：丙酮酸氧化酶编码基因pox、磷酸转乙酰基酶编码基因pta、富马酸还原酶亚基a编码基因frda、乳酸脱氢酶编码基因ldh、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflb和乙醇脱氢酶编码基因adhe。
10、(8)根据(2)所述的方法，其中所述引入外源l-缬氨酸生物合成途径包括，在所述出发菌株中引入以下一种或多种基因的编码序列：二羟基酸脱水酶基因、l-亮氨酸脱氢酶基因和乙酰羟酸异构还原酶基因。
11、(9)根据(8)所述的方法，其中所述引入外源l-缬氨酸生物合成途径包括，在所述出发菌株中引入以下一种或多种基因的编码序列：二羟基酸脱水酶基因pudht、二羟基酸脱水酶基因dhad、二羟基酸脱水酶基因ilvd、l-亮氨酸脱氢酶基因bcd、乙酰羟酸异构还原酶的辅因子偏好性突变蛋白基因ilvcm。
12、(10)根据(2)所述的方法，其中所述改造还包括，优化所述出发菌株中的l-缬氨酸合成通量和/或加强l-缬氨酸外排。
13、(11)根据(10)所述的方法，其中所述优化所述出发菌株中的l-缬氨酸合成通量和/或加强l-缬氨酸外排包括，在所述出发菌株中引入以下一种或多种基因的编码序列：乙酰羟酸异构还原酶的辅因子偏好性突变蛋白基因ilvcm、支链氨基酸转运蛋白基因brnfe、支链氨基酸转运蛋白基因ygazh、α-乙酰乳酸合酶基因alss、α-乙酰乳酸合酶基因budb、乙酰羟酸异构还原酶基因ilvc、二羟基酸脱水酶基因dhad、二羟基酸脱水酶基因ilvd。
14、(12)根据(8)、(9)、(11)中任一项所述的方法，其中所述的在所述出发菌株中引入包括，在所述出发菌株的基因组中整合或在所述出发菌株中以质粒形式表达；优选地，所述引入包括引入单拷贝或多拷贝的所述基因的编码序列；优选地，将所述基因的编码序列以各自的单基因表达片段的方式或以所述基因编码序列的串联表达片段的方式引入。
15、(13)根据(9)所述的方法，其中所述二羟基酸脱水酶基因pudht来自解脲副产碱菌(paralcaligenes ureilyticus)、所述二羟基酸脱水酶基因dhad来自硫磺矿硫化叶菌(sulfolobus solfataricus)、所述二本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种构建L-缬氨酸生产菌株的方法，其特征在于，以2,3-丁二醇或乙偶姻生产菌株为出发菌株，对所述菌株进行基因工程改造以提高其L-缬氨酸产量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中对所述菌株进行以下改造：1)增加α-乙酰乳酸的合成；2)引入外源L-缬氨酸生物合成途径。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述出发菌株选自克雷伯氏菌属、肠杆菌属、芽孢杆菌属、棒杆菌属和弧菌属微生物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述出发菌株选自产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、需钠弧菌(Vibrio natriegens)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述增加α-乙酰乳酸的合成包括：i)抑制乙偶姻和/或2,3-丁二醇的合成；和/或ii)抑制乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸和/或乳酸的合成。
<...【技术特征摘要】
1.一种构建l-缬氨酸生产菌株的方法，其特征在于，以2,3-丁二醇或乙偶姻生产菌株为出发菌株，对所述菌株进行基因工程改造以提高其l-缬氨酸产量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中对所述菌株进行以下改造：1)增加α-乙酰乳酸的合成；2)引入外源l-缬氨酸生物合成途径。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述出发菌株选自克雷伯氏菌属、肠杆菌属、芽孢杆菌属、棒杆菌属和弧菌属微生物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述出发菌株选自产酸克雷伯氏菌(klebsiellaoxytoca)、阴沟肠杆菌(enterobacter cloacae)、大肠杆菌(escherichia coli)、需钠弧菌(vibrio natriegens)、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)和地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述增加α-乙酰乳酸的合成包括：i)抑制乙偶姻和/或2,3-丁二醇的合成；和/或ii)抑制乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸和/或乳酸的合成。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述抑制乙偶姻和/或2,3-丁二醇的合成包括，敲除或敲减所述出发菌株中的以下一个或多个编码基因：α-乙酰乳酸脱羧酶编码基因buda、2,3-丁二醇脱氢酶编码基因budc和甘油脱氢酶编码基因glda。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述抑制乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸和/或乳酸的合成包括，敲除或敲减所述出发菌株中的以下一个或多个编码基因：丙酮酸氧化酶编码基因pox、磷酸转乙酰基酶编码基因pta、富马酸还原酶亚基a编码基因frda、乳酸脱氢酶编码基因ldh、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflb和乙醇脱氢酶编码基因adhe。
8.根据权利要求2所述的方法，其中所述引入外源l-缬氨酸生物合成途径包括，在所述出发菌株中引入以下一种或多种基因的编码序列：二羟基酸脱水酶基因、l-亮氨酸脱氢酶基因和乙酰羟酸异构还原酶基因。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述引入外源l-缬氨酸生物合成途径包括，在所述出发菌株中引入以下一种或多种基因的编码序列：二羟基酸脱水酶基因pudht、二羟基酸脱水酶基因dhad、二羟基酸脱水酶基因ilvd、l-亮氨酸脱氢酶基因bcd、乙酰羟酸异构还原酶的辅因子偏好性突变蛋白基因ilvcm。
10.根据权利要求2所述的方法，其中所述改造还包括，优化所述出发菌株中的l-缬氨酸合成通量和/或加强l-缬氨酸外排。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述优化所述出发菌株中的l-缬氨酸合成通量和/或加强l-缬氨酸外排包括，在所述出发菌株中引入以下一种或多种基因的编码序列：乙酰羟酸异构还原酶的辅因子偏好性突变蛋白基因ilvcm、支链氨基酸转运蛋白基因brnfe、支链氨基酸转运蛋白基因ygazh、α-乙酰乳酸合酶基因alss、α-乙酰乳酸合酶基因budb、乙酰羟酸异构还原酶基...
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