【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，尤其涉及到一种通过共转化方法提高烟草瞬时表达效率的方法。
技术介绍
1、目前，大量的外源重组蛋白已经在植物中表达，尤其烟草作为宿主平台具有高效的基因转化和表达能力，能高效表达外源基因，被广泛用于医药蛋白的研发。但是转基因植物往往无法满足重组蛋白的市场化需求，所以这就需要瞬时表达这个高效的体系来解决。目前已经有大量的研究来优化烟草的瞬时表达系统，例如启动子、密码子的优化、沉默抑制子的共表达等。尽管如此，在瞬时表达过程中，外源病原菌的入侵依旧可以引发强烈的触发免疫(pti)和效应物触发免疫(eti)，以及来自植物病原体的其他基因入侵，都可以导致次生代谢物的积累以及诱导细胞死亡，这些都最后都有可能导致重组蛋白产量的降低。
2、丁香假单胞菌(pseudomonas syringae)是一种常见的植物病原菌，为了成功侵染植物并抵御宿主的免疫防御，丁香假单胞菌产生了一系列的效应蛋白，其中avrpto和avrpto b是其中两个重要的蛋白，avrpto b-c为abranmovith等构建的仅包括n端1-308个氨基酸序列的avrpto b-c末端的缺失突变体，发现其也能够引起烟草的hr反应。avrpto功能主要在于干扰植物的免疫反应，从而促进病原菌的侵染。avrpto b功能与avrpto类似，主要是干扰植物的信号转导途径，特别是通过破坏植物免疫激活蛋白(如pto蛋白)的稳定性来抑制免疫反应，同时丁香假单胞菌也被可以引起本氏烟草瞬时表达系统中的hr反应。这些研究揭示avrpto在植物免疫途径中的作用机制，并为
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种通过共转化方法提高烟草瞬时表达效率的方法，该方法通过构建avrpto的烟草瞬时表达载体，基于简单的共转化方法，无需转基因材料，即可验证avrpto的功能，结果发现在avrpto材料中报告基因gfp和luc的表达量均明显高于对照处理，可认为avrpto能够有效地促进农杆菌介导的烟草瞬时转化效率，这将有助于开发更高效的烟草瞬时转化系统。
2、为了达到上述目的，一种通过共转化方法提高烟草瞬时表达效率的方法，通过将构建的avrpto瞬时表达载体与报告基因gfp或luc共转化烟草实现。
3、作为优选，所述构建的avrpto瞬时表达载体选自pyg42-avrpto-flag、pyg42-avrptob-flag、pyg42-avrptob-c-flag瞬时表达载体中的至少一种。
4、作为优选，所述构建的avrpto瞬时表达载体为pyg42-avrpto-flag或pyg42-avrptob-flag。
5、作为优选，所述pyg42-avrpto-flag、pyg42-avrptob-flag、pyg42-avrptob-c-flag瞬时表达载体通过以下方法构建得到：
6、使用同源重组引物扩增出avrpto、avrptob、avrptob-c基因，并将纯化好的pcr反应产物通过同源重组酶连接至pyg42载体，转化大肠杆菌感受态细胞，将测序正确的阳性单克隆提取重组质粒，并将其转化农杆菌感受态，即得到pyg42-avrpto-flag、pyg42-avrptob-flag、pyg42-avrptob-c-flag瞬时表达载体。
7、作为优选，所述avrpto、avrptob、avrptob-c基因的核苷酸序列依次如seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3所示。
8、作为优选，通过将构建的avrpto瞬时表达载体与报告基因gfp或luc共转化烟草实现具体为：
9、设定构建的avrpto瞬时表达载体的农杆菌渗透液od＝1.0，luc农杆菌渗透液od＝0.2或gfp农杆菌渗透液od值＝0.02，避光培养，将构建的avrpto瞬时表达载体的农杆菌渗透液与luc农杆菌渗透液或gfp农杆菌渗透液分别等比例混合，吸取混合渗透液注射到正常生长5-6周的烟草叶片背面即可
10、与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果在于：
11、本专利技术构建了avrpto的烟草瞬时表达载体，通过简单的共转化方法，无需转基因材料，即可验证avrpto的功能，结果发现在avrpto材料中报告基因gfp和luc的表达量均明显高于对照处理，可认为avrpto能够有效地促进农杆菌介导的烟草瞬时转化效率，这将有助于开发更高效的烟草瞬时转化系统。
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1.一种通过共转化方法提高烟草瞬时表达效率的方法，其特征在于，通过将构建的AvrPto瞬时表达载体与报告基因GFP或Luc共转化烟草实现。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述构建的AvrPto瞬时表达载体选自PYG42-AvrPto-Flag、PYG42-AvrPtoB-Flag、PYG42-AvrPtoB-C-Flag瞬时表达载体中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述构建的AvrPto瞬时表达载体为PYG42-AvrPto-Flag或PYG42-AvrPtoB-Flag。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述PYG42-AvrPto-Flag、PYG42-AvrPtoB-Flag、PYG42-AvrPtoB-C-Flag瞬时表达载体通过以下方法构建得到：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述AvrPto、AvrPtoB、AvrPtoB-C基因的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示。
6.根据权利要求1所述的
...【技术特征摘要】
1.一种通过共转化方法提高烟草瞬时表达效率的方法，其特征在于，通过将构建的avrpto瞬时表达载体与报告基因gfp或luc共转化烟草实现。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述构建的avrpto瞬时表达载体选自pyg42-avrpto-flag、pyg42-avrptob-flag、pyg42-avrptob-c-flag瞬时表达载体中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述构建的avrpto瞬时表达载体为pyg42-avrpto-flag或pyg42-avrptob-flag。
<...【专利技术属性】
技术研发人员：张增林，郭永峰，吴荣荣，芮庆臣，
申请(专利权)人：中国农业科学院烟草研究所中国烟草总公司青州烟草研究所，
类型：发明
国别省市：
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