【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其是涉及一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化细胞及其制备与应用。
技术介绍
1、甜味是人类与生俱来的味觉追求。然而，长期以来由糖类过度摄入引起的超重、糖尿病、“三高”之类的慢性疾病以及由此产生的一系列次生健康问题也日益凸显。美味和健康始终是民众向往美好生活的双重需求，因此，低热量甜味替代品的开发和应用成为同时保证美味和健康的有效途径。
2、阿洛酮糖(d-allulose)是一款与蔗糖理化性质、质构特征、加工性能最为接近的低热量甜味剂，它的甜度为蔗糖的70％，但热量只有0.4kcal/g，其具有减少膳食d-果糖和d-葡萄糖的吸收、增强胰岛素抵抗、抗肥胖活性、降血脂等理化性质。d-阿洛酮糖因其较高的甜度和较低的能量以及独特的生理功能和潜在的健康益处，已成为全球范围内稀有糖生物合成领域的研究热点。
3、d-阿洛酮糖(d-allulose)属于己酮糖，是d-果糖的c-3差向异构体，目前d-阿洛酮糖的合成主要分为化学合成法和生物催化法，但化学合成法因其具有分离困难、副产物多、化学废物的产生等较难克服的共性缺点，在工业中已很少使用，绿色环保的生物酶法利用d-阿洛酮糖-3-差向异构酶可以催化d-果糖生成d-阿洛酮糖，且无副产物生成，是高效生产d-阿洛酮糖的方式。
4、然而，生物酶法合成d-阿洛酮糖的过程中，由于游离酶在催化反应结束后，收集困难且重复使用的过程中会造成细胞破损，不利于自动化生产且操作过程复杂。
5、固定化载体有无机载体、有机载体、复合载体，其中复合载体具有两
6、因此，在不影响酶的稳定性及催化活性的前提下，开发一种固定化细胞的方法，既能解决游离酶反应后收集困难等问题，也可以解决酶的催化效率低，多次重复反应后残余酶活低等问题，这对d-阿洛酮糖的产业发展具有十分重要的意义。
技术实现思路
1、为了解决游离酶的生产弊端，本专利技术的目的是提供一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化细胞及其制备与应用。本专利技术通过固定化细胞技术将d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化(海藻酸钠-羧甲基壳聚糖包埋法固定高产d-阿洛酮糖-3-差向异构酶全细胞)。与游离酶相比，固定化细胞不仅能保持酶催化高效和专一的特点，而且能大大提高酶的热稳定性和化学稳定性。同时，固定化细胞与反应产物可以利用离心或过滤等简单方式加以分离，有利于酶的多次重复使用及产品的纯化。
2、本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
3、本专利技术的第一个目的是提供一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化细胞的制备方法，包括以下步骤：
4、(s1)将羧甲基壳聚糖与海藻酸钠混匀，得到第一溶液；
5、(s2)将表达d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的重组菌培养后后处理得到细胞溶液；
6、(s3)将步骤(s2)收集到的细胞溶液与步骤(s1)制备得到的第一溶液混匀，得到第二溶液；
7、(s4)将步骤(s3)制备得到的第二溶液滴入cacl2溶液中，得到微球后进行硬化处理，得到预处理微球；
8、(s5)将步骤(s4)制备得到的预处理微球与戊二醛中，交联后得到d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化细胞。
9、在本专利技术的一个实施方式中，步骤(s1)中，羧甲基壳聚糖与海藻酸钠的质量比为2.5：1-2。
10、在本专利技术的一个实施方式中，步骤(s2)中，所述表达d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的重组菌为含有pmate05-dp质粒的枯草芽孢杆菌，所述pmate05-pd质粒中含有编码d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的基因序列；
11、编码d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的基因序列如seq id no.1所示。
12、在本专利技术的一个实施方式中，表达d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的重组菌的制备方法包括以下步骤：
13、(a1)将编码d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的基因序列插入pmate05质粒载体中，得到pmate05-pd质粒；
14、(b2)将pmate05-pd质粒转入b.subtilis168细胞中，得到表达d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的重组菌：b.subtilis168/pmate05-dp。
15、在本专利技术的一个实施方式中，步骤(s2)中，所述后处理为将得到的发酵液离心后重悬细胞；
16、其中，细胞溶液中，细胞的浓度为60-80g/l。
17、在本专利技术的一个实施方式中，步骤(s3)中，细胞与第一溶液的用量比为60-80g：1l。
18、在本专利技术的一个实施方式中，步骤(s4)中，所述cacl2溶液的浓度为2wt％。
19、在本专利技术的一个实施方式中，步骤(s4)中，硬化处理过程中，温度为0-4℃，时间为4-6h。
20、在本专利技术的一个实施方式中，步骤(s5)中，戊二醛的浓度为0.03wt％。
21、在本专利技术的一个实施方式中，步骤(s5)中，戊二醛的浓度为0.5wt％-1.0wt％。
22、在本专利技术的一个实施方式中，步骤(s5)中，交联过程中，温度为0-4℃，时间为12-16h。
23、本专利技术的第二个目的是提供一种通过上述方法制备得到的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化细胞。
24、本专利技术的第三个目的是提供一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化细胞在生产d-阿洛酮糖中的应用。
25、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
26、(1)本专利技术中，海藻酸钠荷负电，壳聚糖荷正电，两者通过静电相互作用形成微囊作为大分子蛋白的载体，其不涉及热交联过程中的高温及化学交联过程中的共价键形成，不会影响包载物的性质，因此，利用海藻酸钠-羧甲基壳聚糖包埋法制备得到的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化细胞有利于保持d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的稳定性以及催化活性。
27、(2)本专利技术的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化细胞可以反复回收利用，在实现高效生产d-阿洛酮糖的同时简化了酶与产物分离等操作；d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化细胞具有良好的连续转化能力，以700g/l果糖为底物重复10次催化反应后，仍保持28％的转化率、92％的残余酶活，且其机械强度仍然能够维持在95％以上。
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1.一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化细胞的制备方法，其特征在于，步骤(S1)中，羧甲基壳聚糖与海藻酸钠的质量比为2.5：1-2。
3.根据权利要求1所述的一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化细胞的制备方法，其特征在于，步骤(S2)中，所述表达D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的重组菌为含有PMATE05-DP质粒的枯草芽孢杆菌，所述PMATE05-PD质粒中含有编码D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的基因；
4.根据权利要求3所述的一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化细胞的制备方法，其特征在于，表达D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的重组菌的制备包括以下步骤：
5.根据权利要求1所述的一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化细胞的制备方法，其特征在于，步骤(S3)中，细胞与第一溶液的用量比为60-80g：1L。
6.根据权利要求1所述的一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化细胞的制备方法，其特征在于，步骤(S4)中，硬化处理过
7.根据权利要求1所述的一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化细胞的制备方法，其特征在于，步骤(S5)中，戊二醛的浓度为0.5wt％-1.0wt％。
8.根据权利要求1所述的一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化细胞的制备方法，其特征在于，步骤(S5)中，交联过程中，时间为12-16h。
9.一种如权利要求1-8任一所述方法制备得到的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化细胞。
10.一种如权利要求9所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化细胞在生产D-阿洛酮糖中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化细胞的制备方法，其特征在于，步骤(s1)中，羧甲基壳聚糖与海藻酸钠的质量比为2.5：1-2。
3.根据权利要求1所述的一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化细胞的制备方法，其特征在于，步骤(s2)中，所述表达d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的重组菌为含有pmate05-dp质粒的枯草芽孢杆菌，所述pmate05-pd质粒中含有编码d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的基因；
4.根据权利要求3所述的一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化细胞的制备方法，其特征在于，表达d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的重组菌的制备包括以下步骤：
5.根据权利要求1所述的一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化细...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈竞凯，韩文秀，
申请(专利权)人：熙甜上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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