【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别涉及一种基于核酸质谱的多重超敏体细胞突变检测方法。
技术介绍
1、体细胞突变是相对于胚系突变而言的。胚系突变指的是在有性生殖过程中，由生殖细胞携带的突变，这种突变在该个体的每个细胞当中均存在，并且可以遗传到下一代；而体细胞突变则与之相对，是在个体生长发育过程中，由于诱变因素的影响在部分体细胞中积累的突变。这种突变仅出现在身体的少数部位，并且不会被随着生殖细胞遗传到下一代。
2、体细胞突变检测是肿瘤基因组方面研究的重中之重。体细胞突变检测主要针对组织样本和血液样本。组织样本检测是基因检测癌症的最可靠方法，血液样本检测则是通过测定肿瘤细胞释放到血液循环系统中的dna来评估癌症关键基因的突变。在肿瘤体细胞突变检测中，无论是组织检测还是液体活检，对检测技术的灵敏度都要求极高，尤其是液体活检的灵敏度需至少达到0.1%。
3、目前体细胞突变检测技术应用较多的有探针扩增阻滞突变系统、数字pcr、二代测序等。探针扩增阻滞突变系统受限于需要特殊探针，每次仅能检测少数几种突变；数字pcr检测灵敏，然而成本高昂、通量有限、操作繁琐。二代测序的通量高，同时可通过提高测序深度提高检测灵敏度，然而仍面临分析复杂、费用昂贵、变异位点意义不明确等问题。因此肿瘤体细胞突变检测领域仍需要更适合临床应用的技术。
4、常规的核酸质谱基于多重扩增单碱基延伸的方法，通常用于基因分型，如snp，病原体检测等，即pcr扩增的目标序列，进行单碱基延伸反应。单碱基延伸是紧挨着snp位点设计单碱基延伸引物，在反应体系中以d
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种基于核酸质谱的多重超敏体细胞突变检测方法，通过deep-seek技术，利用核酸质谱平台优势，创新性地开发出一种基于核酸质谱的多重超敏体细胞突变检测方法，有效降低野生型延伸产物对检测结果的影响。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了检测体细胞突变的引物探针组，包括上游引物、下游引物、阻遏探针、单碱基延伸引物，所述上游引物的3′端序列与所述阻遏探针的5′端序列相同，其中相同的部分碱基数为8~16；或
4、所述下游引物5′端部分序列与所述阻遏探针的3′端部分序列相同，其中相同的部分碱基数为8~16。
5、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述引物探针组的所述上游引物和下游引物的5′端含有通用序列；
6、所述通用序列包括acgttggatg（seq id no: 6）。
7、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述引物探针组的所述阻遏探针序列与野生型模板完全匹配，仅3′端进行化学修饰，包括但不限于磷酸化修饰。
8、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述引物探针组的所述上游引物与下游引物的摩尔比为1:(2~10)；或
9、所述上游引物与下游引物的摩尔比为(2~10):1。
10、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述引物探针组的所述上游引物具有：
11、（1）、如seq id no: 1所示的核苷酸序列；或
12、（2）、如（1）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与（1）的相同或相似；或
13、（3）、与如（1）或（2）所示的核苷酸序列至少有50%同源性的核苷酸序列；
14、所述下游引物具有：
15、（4）、如seq id no: 2所示的核苷酸序列；或
16、（5）、如（4）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与（4）的相同或相似；或
17、（6）、与如（4）或（5）所示的核苷酸序列至少有50%同源性的核苷酸序列；
18、所述阻遏探针具有：
19、（7）、如seq id no: 3所示的核苷酸序列；或
20、（8）、如（7）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与（7）的相同或相似；或
21、（9）、与如（7）或（8）所示的核苷酸序列至少有50%同源性的核苷酸序列；
22、所述单碱基延伸引物具有：
23、（10）、如seq id no: 4所示的核苷酸序列；或
24、（11）、如（10）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与（10）的相同或相似；或
25、（12）、与如（10）或（11）所示的核苷酸序列至少有50%同源性的核苷酸序列；
26、所述多个为2个至3个。
27、本专利技术还提供了上述引物探针组在制备体细胞突变检测试剂或试剂盒中的应用。
28、本专利技术还提供了试剂，包括上述引物探针组，以及可接受的辅料或助剂。
29、本专利技术还提供了试剂盒，包括上述试剂，以及可接受的辅料或助剂。
30、本专利技术还提供了体细胞突变的检测方法，其基于上述引物探针组、上述试剂或上述试剂盒检测。
31、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述检测方法包括如下步骤：
32、步骤（1）：取待测核酸样品与扩增反应试剂、上述引物探针组的所述上游引物、上述引物探针组的所述下游引物、上述引物探针组的所述阻遏探针混合，进行扩增，获得扩增产物；
33、步骤（2）：对所述扩增产物进行sap，获得sap产物；
34、步骤（3）：取延伸反应试剂、所述sap产物与上述引物探针组的所述单碱基延伸引物混合，进行延伸反应，获得延伸产物；
35、步骤（4）：取所述延伸产物进行核酸质谱，获得检测结果；
36、所述延伸反应试剂中仅包含与体细胞突变位点相同的ddntp或acyntp；所述acyntp包括acyctp、acyatp、acygtp和/或acyttp，延伸体系中终浓度为0.11~0.22 mmol/l。
37、本专利技术的体细胞突变检测方法有如下效果：
38、本专利技术所述的基于核酸质谱的多重超敏体细胞突变检测方法，利用核酸质谱的优势可实现一次检测多个突变位点，具有较高性价比。同时，区别于常规的核酸质谱多重扩增单碱基延伸方法，本专利技术提供的deep-seek技术通过创新的理念，设计出适用于核酸质谱体细胞突变检测的pcr扩增体系、阻遏探针和单碱基引物以及各自的非对称扩增反应体系、特异性的单碱基延伸体系，极大地提高了体细胞突变的检出，检出限可达0.1%，部分位点甚至可达0.05%，具有极高的灵敏性。
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1.检测体细胞突变的引物探针组，包括上游引物、下游引物、阻遏探针、单碱基延伸引物，其特征在于，所述上游引物的3′端序列与所述阻遏探针的5′端序列相同，其中相同的部分碱基数为8~16；或
2.如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述上游引物和所述下游引物的5′端含有通用序列；
3.如权利要求2所述的引物探针组，其特征在于，所述阻遏探针在序列上与野生型模板完全匹配，仅3′端进行化学修饰，所述化学修饰包括磷酸化修饰。
4.如权利要求3所述的引物探针组，其特征在于，所述上游引物与所述下游引物的摩尔比为1:(2~10)；或
5.如权利要求4所述的引物探针组，其特征在于，所述上游引物的序列如SEQ ID NO: 1所示；
6.如权利要求1至5任一项所述的引物探针组在制备体细胞突变检测试剂或试剂盒中的应用。
7.试剂，其特征在于，包括如权利要求1至5任一项所述的引物探针组，以及可接受的辅料或助剂。
8.试剂盒，其特征在于，包括如权利要求7所述的试剂，以及可接受的辅料或助剂。
9.非诊断目的的体
10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.检测体细胞突变的引物探针组，包括上游引物、下游引物、阻遏探针、单碱基延伸引物，其特征在于，所述上游引物的3′端序列与所述阻遏探针的5′端序列相同，其中相同的部分碱基数为8~16；或
2.如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述上游引物和所述下游引物的5′端含有通用序列；
3.如权利要求2所述的引物探针组，其特征在于，所述阻遏探针在序列上与野生型模板完全匹配，仅3′端进行化学修饰，所述化学修饰包括磷酸化修饰。
4.如权利要求3所述的引物探针组，其特征在于，所述上游引物与所述下游引物的摩尔比为1:(2~10)；或
5.如权利要求4所述的引物...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐明，郭惠民，裘振亚，姜育燊，刘贺，
申请(专利权)人：杭州迪谱医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：
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