【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种定量检测嵌合抗原受体基因含量的方法及其应用。
技术介绍
1、嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor t-cell，car-t)免疫疗法是目前肿瘤免疫治疗中最有希望治愈肿瘤的方法之一，其在血液肿瘤的治疗中显示出非常积极的疗效，正在彻底改变癌症免疫治疗领域。给药前与给药后对car-t细胞产品的拷贝数检测是产品放行和临床实验伴随检测的重要方法，然而car的共刺激信号不同的情况下，需要根据不同的共刺激信号建立不同的拷贝数检测方法，增加了检测的复杂性和方法建立的时间成本；针对cd19-car同样存在此问题，但是，cd19-car目前大多数的产品开发均使用的fmc63或其人源化作为car结构中的scfv，因此，需要建立一个针对fmc63 cd19抗体及fmc63人源化cd19抗体的具有通用性、检测准确度和灵敏度都较高的检测方法。
技术实现思路
1、本专利技术目的是提供一种检测包含如seq id no:1所示目的基因及包含如seq idno:1所示目的基因的car-t的方法，具体的。本专利技术中的实施例部分所测物质为fmc63的人源化scfv的car-t产品。
2、本专利技术提供一种引物对，引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列如seq id no:2所示或与seq id no:2有85％以上序列相似性的序列或在3’端有15bp碱基完全一致，所述反向引物的序列如seq id no:3所示或与seq id no:
3、进一步的，本专利技术提供一种试剂盒，所述试剂盒包括如前所述的引物对。
4、进一步的，所述试剂盒还包括探针的序列如seq id no:4所示或与seq idno:4有85％以上序列相似性的序列。
5、进一步的，探针的两端进行核苷酸修饰，探针的5’端标记荧光染料报告基团，3’端标记淬灭基团，或者在探针内部额外添加第二个淬灭基团，使得淬灭效果更加完全。
6、进一步的，荧光染料报告基团可以选择fitc、fam、vic、afc、ned、amc、rox、sulforhodamine101、5-tamra、edans texas red、5-tamra、5-lodoacetamidofluorescein，优选fam、vic、ned。
7、进一步的，淬灭基团可以选择bhq1、tamra、mgb、joe、bhq2、bhq3，优选mgb。
8、进一步的，探针的碱基可以进行碱基修饰，包括不限于锁核酸(locked nucleicacid,lna)、肽核酸修饰。
9、进一步的，所述试剂盒还包括参比基因的正向引物、反向引物和/或探针。
10、进一步的，所述参比基因为人类基因组中拷贝数固定，且序列高度保守，参比基因选自pcbp2、gapdh、actin、cdkn1a、alb，优选的，所述参比基因为pcbp2。
11、进一步的，所述pcbp2的正向引物的序列如seq id no:5所示或与seq idno:5有85％以上序列相似性的序列；反向引物的序列如seq id no:6所示或与seq id no:6有85％以上序列相似性的序列或在3’端有15bp碱基完全一致；
12、进一步的，所述探针的序列如seq id no:7所示或与seq id no:7有85％以上序列相似性的序列。
13、本专利技术提供一种用途，所述用途为采用如上所述任意一项所述的引物对或如上所述的试剂盒用于定量检测包含如seq id no:1所示目的基因。
14、本专利技术还提供一种用途，所述用途为采用如上所述任意一项所述的引物对或如上所述的试剂盒用于包含如seq id no:1所示目的基因的car-t细胞制剂的质量控制。
15、本专利技术提供采用如上所述任意一项所述的引物对和探针或如上所述的试剂盒的使用方法，使用方法为采用荧光定量pcr检测，利用所述引物对参与荧光定量pcr检测反应并检测dna残留的含量。
16、进一步的，pcr检测的反应条件为：预变性：50℃，2min，95℃，10min；40个循环：95℃，15s，60℃，1min。
17、本专利技术中的试剂盒，可以还包含无核酸酶水、逆转录酶、聚合酶、三磷酸脱氧核苷酸、缓冲液、rna酶和dna酶中的一种或多种。
18、本专利技术中的参比基因可以为pcbp2/gapdh/actin/cdkn1a/alb，参比基因的选择不会影响检测的结果。
19、pcr检测设计过程中可能会设计成千上万的引物探针，但是引物探针之间可能会存在相互冲突，不是任何的探针引物组合都可以达到检测目的，最后得到我们的引物探针对需要付出大量的创造性劳动。
20、本专利技术中的反向引物、正向引物以及探针序列的3’端碱基在整条引物中只保留85％的碱基或在3’端有15bp碱基完全一致均可以进行有效拷贝数检测。
21、只要包含本专利技术中的检测目的基因，都可以采用本专利技术中的引物对、引物对和探针或者试剂盒进行检测，具体的可以用于fmc63及fmc63的人源化scfv的car-t产品的检测。
22、本专利技术中可以使用引物对进行染料法定量检测或使用引物对加探针进行taqman定量检测，同时也可以目的基因或参比基因其中一个使用染料法或探针法进行拷贝数检测。
23、有益效果：
24、本专利技术中设计的引物探针以及试剂盒可以精准的检测包含如seq id no:1所示目的基因以及包含如seq id no:1所示目的基因的car-t，且检测准确灵敏度高，对car-t细胞制剂的质量控制放行检测具有较高的参考价值，可以缩短car-t质控时间，适于推广应用，具体的，本专利技术中的实施例部分所测物质为fmc63的人源化scfv的car-t产品。
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1.引物对，引物对包括正向引物和反向引物，其特征在于：所述正向引物的序列如SEQID NO:2所示或与SEQ ID NO:2有85％以上序列相似性的序列或在3’端有15bp碱基完全一致，所述反向引物的序列如SEQ ID NO:3所示或与SEQ ID NO:3有85％以上序列相似性的序列或在3’端有15bp碱基完全一致。
2.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物对。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括探针，所述探针的序列如SEQ ID NO:4所示或与SEQ ID NO:4有85％以上序列相似性的序列。
4.如权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括参比基因的正向引物、反向引物和/或探针。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述参比基因选自PCBP2、GAPDH、ACTIN、CDKN1A、ALB，优选的，所述参比基因为PCBP2。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述PCBP2的正向引物的序列如SEQ IDNO:5所示或与SEQ ID NO:
7.一种采用如权利要求1所述的引物对或如权利要求2-6任意一项所述的试剂盒用于定量检测包含如SEQ ID NO:1所示目的基因的用途。
8.一种采用如权利要求1所述的引物对或如权利要求2-6任意一项所述的试剂盒用于包含如SEQ ID NO:1所示目的基因的CAR-T细胞制剂的质量控制、CAR-T体内药代动力学检测中的用途。
9.一种使用如权利要求1所述的引物对或如权利要求2-6任意一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：使用方法为采用荧光定量PCR检测，利用所述引物对参与荧光定量PCR检测反应并检测DNA的含量。
10.如权利要求9所述的使用方法，其特征在于：PCR检测的反应条件为：预变性：50℃，2min，95℃，10min；40个循环：95℃，15s，60℃，1min。
...【技术特征摘要】
1.引物对，引物对包括正向引物和反向引物，其特征在于：所述正向引物的序列如seqid no:2所示或与seq id no:2有85％以上序列相似性的序列或在3’端有15bp碱基完全一致，所述反向引物的序列如seq id no:3所示或与seq id no:3有85％以上序列相似性的序列或在3’端有15bp碱基完全一致。
2.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物对。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括探针，所述探针的序列如seq id no:4所示或与seq id no:4有85％以上序列相似性的序列。
4.如权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括参比基因的正向引物、反向引物和/或探针。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述参比基因选自pcbp2、gapdh、actin、cdkn1a、alb，优选的，所述参比基因为pcbp2。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述pcbp2的正向引物的序列如seq idno:5所示或与seq id no:5有85％以上序列相...
【专利技术属性】
技术研发人员：代德鹏，罗洋，杜学敏，黄霞，朱巍，于彩平，沈俊杰，张茜真，
申请(专利权)人：重庆精准生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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