【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于物质检测，尤其涉及一种阿加曲班原料中基因毒性杂质的测定方法。
技术介绍
1、阿加曲班为一种直接凝血酶抑制剂，于20世纪80年代初，首次在日本上市，用于临床治疗周围动脉闭塞性疾病，是新型抗凝药的代表。阿加曲班原料合成过程中，采用dcc（二环己基碳二亚胺）作为脱水剂使用，其含量的控制对于本品质量情况的体现至关重要。经美国国家毒理部网站（national toxicology program）检索，在为期92天的小鼠毒理实验微核试验中dcc显弱阳性。参考ich m7《评估和控制药物中dna反应性（致突变）杂质以限制潜在致癌风险》，使用毒理学关注阈值（ttc）1.5 mg/d作为该基因毒性杂质的可接受限度。但目前国内外药典中均未收载关于本杂质的研究方法。
2、文献《混合固定相色谱法测定n,n’-二环己基碳二亚胺》与《气相色谱法分析n,n'-二环己基碳二亚胺的纯度》均采用气相检测手段按普通化合物进行dcc的测定，但以上方法均为dcc高浓度样品的测定，以dcc为研究主体，考察其可能存在的杂质的含量，未对化合物dcc微量含量层面进行测定方法的研究。另外公开号为cn116699015a的中国专利公开了一种阿加曲班基因毒性杂质的检测方法，涉及的基因毒性杂质为3-甲基-8-喹啉磺酸乙酯与3-甲基-8-喹啉磺酸甘油酯。经检索，已有文献或专利并未对二环己基碳二亚胺微量层面进行含量测定。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种稳定性好、重复性好、操作简单
2、本专利技术以高效液相色谱为研究方向，辅助质谱仪器进行定量微量检测，填补了该化合物作为基因毒性杂质的微量定量测定的空白。采用本专利方法，能较好提高方法的检测灵敏度，且可操作性强，具有较高的准确度及精密度。
3、本专利技术目的在于提供一种阿加曲班原料中基因毒性杂质的测定方法，其步骤包括，采用液相色谱和质谱联用对待测液进行检测；所述待测液包含阿加曲班原料；
4、液相色谱条件包括：
5、色谱柱采用苯基填料色谱柱；
6、流动相包括流动相a与流动相b；所述流动相a为甲酸水溶液；所述流动相b为乙腈；
7、质谱条件包括：
8、离子源：电喷雾离子源esi，正离子模式；
9、采集方式为：mrm多反应监测模式。
10、在一些优选地实施方案中，所述待测液中阿加曲班原料的浓度为0.5~2 mg/ml，优选为1.00 mg/ml。
11、在一些优选地实施方案中，所述待测液还包含二环己基碳二亚胺和/或(2r,4r)-1-[ng-硝基-n2-(叔丁氧羰基)-l-精氨酸]-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯。
12、在一些优选地实施方案中，所述待测液的溶剂为乙腈。
13、在一些优选地实施方案中，所述液相色谱的条件中，色谱柱的种类选用：agilentzorbax sb-phenyl或ultimate xb-phenyl；优选为agilent zorbax sb-phenyl。
14、在一些优选地实施方案中，所述甲酸水溶液中甲酸的体积浓度为0.008%~0.012%，优选为0.01%。
15、在一些优选地实施方案中，所述流动相的比例为甲酸水溶液：乙腈=18~22：82~78（体积比）；
16、在一些更优选地实施方案中，所述流动相为，0.01%甲酸水溶液：乙腈=18~22：82~78（体积比）；
17、在一些更优选地实施方案中，所述流动相为，0.01%甲酸水溶液：乙腈=20：80（体积比）；
18、在一些优选地实施方案中，所述液相色谱的条件中，色谱柱规格为3.5 µm，4.6 mm×75 mm。
19、在一些优选地实施方案中，所述液相色谱的条件中，流动相的流速的范围为0.75ml/min~0.85 ml/min，所述的流速优选为0.8 ml/min。
20、在一些优选地实施方案中，所述液相色谱的条件中，色谱柱的柱温的范围为32℃~38℃，优选的柱温为35℃。
21、在一些优选地实施方案中，所述质谱的条件中，质谱质量分析器为三重四级杆ms/ms。
22、在一些优选地实施方案中，所述质谱条件中，气帘气的压力为25psi，离子源的温度为500℃，喷雾气和/或辅助加热气的压力为55psi。
23、在一些优选地实施方案中，所述二环己基碳二亚胺的m/z 207.1→125.3；碰撞电压collision energy(ce)为12~16v，优选为14v；去簇电压declustering potential（dp）为40~60v，优选为50v。
24、在一些优选地实施方案中，所述(2r,4r)-1-[ng-硝基-n2-(叔丁氧羰基)-l-精氨酸]-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯（pm）的m/z 473.2→373.3；碰撞电压collision energy(ce)为15~19v，优选为17v；去簇电压declustering potential（dp）为40~60v，优选为50v。
25、在一些优选地实施方案中，所述液相色谱和质谱联用采用hplc-ms/ms。
26、在一些优选地实施方案中，所述二环己基碳二亚胺在2.56 ng/ml~103.39 ng/ml范围呈现线性关系。
27、在一些优选地实施方案中，所述二环己基碳二亚胺的检测限不高于0.15 ng/ml
28、有益效果：
29、1、本专利技术提供的测定方法对dcc浓度的检测灵敏度高，检测限低至0.15 ng/ml以下。
30、2、本专利技术提供的测定方法的精密度良好，重复测定结果的rsd控制在3.8%以下，小于usp<736>mass spectrometry的限度要求。
31、3、本专利技术提供的测定方法的专属性良好，不受其他成分的干扰。
32、4、本专利技术提供的测定方法的准确度良好，实际测得与理论量计算的回收率，二者相对标准偏差rsd控制在4.2%，远小于限度标准6%以内。
33、5、本专利技术提供的测定方法的耐用性良好，在流速0.75~0.85 ml/min、柱温32~38℃以及不同批次的苯基填料色谱柱条件下，测定结果基本无明显变化，各变动条件下的rsd控制在1.9~4.8%，远小于限度标准rsd小于10%。
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1.一种阿加曲班原料中基因毒性杂质的测定方法，其特征在于，其步骤包括：采用液相色谱与质谱联用对待测液进行检测；所述待测液包含阿加曲班原料；
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述质谱的离子化电压为+4300~+4800 V，优选为+4500~+4800 V。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述色谱柱选自Agilent Zorbax SB-Phenyl或Ultimate XB-Phenyl；优选为Agilent Zorbax SB-Phenyl。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述流动相A与流动相B的体积比为（18~22）：（82~78）；
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述色谱柱的规格为3.5 µm，4.6 mm×75 mm。
6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.75~0.85 mL/min，优选为0.8 mL/min。
7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为32℃~38℃，优选为35℃。p>
8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述质谱的质量分析器为三重四极杆。
9.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述质谱的气帘气的压力为25 psi；离子源的温度为500℃；喷雾气和/或辅助加热气的压力为55 psi。
10.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述待测液还包含二环己基碳二亚胺和/或(2R,4R)-1-[NG-硝基-N2-(叔丁氧羰基)-L-精氨酸]-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯。
11.根据权利要求10所述的测定方法，其特征在于，所述二环己基碳二亚胺的m/z207.1→125.3；碰撞电压为12~16V，优选为14V；去簇电压为40~60V，优选为50V。
12.根据权利要求10所述的测定方法，其特征在于，所述(2R,4R)-1-[NG-硝基-N2-(叔丁氧羰基)-L-精氨酸]-4-甲基-2-哌啶甲酸乙酯的m/z 473.2→373.3；碰撞电压为15~19V，优选为17V；去簇电压为40~60V，优选为50V。
13.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述待测液的溶剂为乙腈。
14.根据权利要求10所述的测定方法，其特征在于，所述二环己基碳二亚胺在2.56 ng/ml~103.39 ng/ml范围呈现线性关系；
...【技术特征摘要】
1.一种阿加曲班原料中基因毒性杂质的测定方法，其特征在于，其步骤包括：采用液相色谱与质谱联用对待测液进行检测；所述待测液包含阿加曲班原料；
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述质谱的离子化电压为+4300~+4800 v，优选为+4500~+4800 v。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述色谱柱选自agilent zorbax sb-phenyl或ultimate xb-phenyl；优选为agilent zorbax sb-phenyl。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述流动相a与流动相b的体积比为（18~22）：（82~78）；
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述色谱柱的规格为3.5 µm，4.6 mm×75 mm。
6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.75~0.85 ml/min，优选为0.8 ml/min。
7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为32℃~38℃，优选为35℃。
8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述质谱的质量分析器为三重...
【专利技术属性】
技术研发人员：安百锋，宋更申，杨建文，马志平，
申请(专利权)人：北京悦康科创医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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