本发明专利技术公开了一种重组酰胺酶、工程菌及在拆分外消旋酮洛芬酰胺中的应用，本发明专利技术提供的重组酰胺酶的氨基酸序列长度更短(仅205个氨基酸)，同时酶的催化时间更短(达到～50％的底物转化率)，催化效率更高。利用所述重组酰胺酶粗酶液催化水解底物，底物浓度10g/L，反应10h，底物的转化率达到了48.9％，产物S‑酮洛芬的eep值为98.5％。
【技术实现步骤摘要】
(一)本专利技术涉及基因工程，特别涉及来源于伯克霍尔德菌(burkholderiasp.)zjutq19的重组酰胺酶、工程菌及在拆分外消旋酮洛芬酰胺中的应用。
技术介绍
0、(二)
技术介绍
1、酮洛芬，英文名称：ketoprofen，化学名称：α-甲基-3-苯甲酰基苯乙酸(cas:22071-15-4)，英文名称：2-(3-benzoyl-phenyl)propionic acid，在羧基的功能基团α碳上有一个手性中心，以质量相等的s-对映体和r-对映体形成外消旋体。它是一种用于治疗轻中度疼痛、发热以及具有缓解炎症作用的优秀非甾体类消炎药物。但是酮洛芬的药理作用主要来自于它s-对映体。鉴于市场上的外消旋体药物都在逐渐被单一对映体取代，同时就成本和功效性来说，制备合成单一光学纯度的s-酮洛芬也将成为市场发展的需求以及此类药物研究发展的方向。
2、目前，s-酮洛芬的制备主要为化学拆分法和生物酶法。而利用生物酶法拆分手性化合物比化学拆分法具有明显的优越性：(1)酶催化的反应通常具有高度的立体专一性。因此得到的产物旋光纯度很高。(2)副反应少，产率高，产品分离提纯简单。(3)酶催化的反应大多在很温和的条件下进行。
3、到目前为止，已报道生物酶法生产s-旋酮洛芬的催化剂主要有两种：第一种是酯酶；第二种是酰胺酶。对映体选择性酶水解制备s-酮洛芬，它通过将将外消旋酮洛芬的衍生物(例如酮洛芬酰胺或酮洛芬酯)当成底物，使用酯酶或酰胺酶等来催化水解外消旋底物当中的s-对映体以此来得到s型产物s-酮洛芬。
<
p>4、酰胺酶(amidase ec 3.5.1.4)是一类可以催化水解酰胺生成相应羧酸和氨的酶，它是一种比较常见存在于自然当中的水解酶。酰胺酶具有广谱的底物，可以水解多类天然和非天然的脂肪族以及芳香族的酰胺。特别是其对α位含手性中心的化合物具有很好的对映体选择性，在制备手性化合物方面具有潜在的应用价值，也因此用于合成手性羧酸、α-氨基酸和酰胺化合物等等，到目前为止，已经在医药和农药行业等一些生物技术有关领域得到了广泛研究与应用。5、目前，用酰胺酶手性拆分生产s-酮洛芬的报道较少。国内可查到的以酰胺酶选择性水解外消旋酮洛芬酰胺制备s-酮洛芬的已知专利分别来自于王小龙等(cn111378637a)、韦德活等(cn113388647a)、罗积杏等(cn116121310 a)，其酰胺酶分别来自于klebsiella属、agrobacterium属以及rhodococcus erythropolis ccm2595，虽然获得的s-酮洛芬ee值均可达99％以上，但是催化时间很长，需要几十甚至上百小时，催化效率低。
技术实现思路
0、(三)
技术实现思路
1、本专利技术目的是提供一种新的能够催化水解外消旋酮洛芬酰胺得到s-酮洛芬的重组酰胺酶、工程菌及在拆分外消旋酮洛芬酰胺中的应用，该酶具有高活性和高对映体s型选择性，一定程度上解决了现有方法中酶催化效率低的问题。
2、本专利技术采用的技术方案是：
3、本专利技术提供一种来源于伯克霍尔德菌(burkholderia sp.)的重组酰胺酶(记为ge01314)，所述重组酰胺酶的氨基酸序列为seq id no.2所示。
4、本专利技术所述伯克霍尔德菌优选为伯克霍尔德菌(burkholderia sp.)zjutq19，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2023年12月06日，保藏编号cctcc no：m20232426，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，已在专利申请202410233252.2中公开。
5、本专利技术还涉及所述重组酰胺酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为seq idno.1所示。
6、由于氨基酸序列的特殊性，任何含有seq no.2所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在80％以上，均属于本专利技术保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
7、本专利技术还提供由所述重组酰胺酶编码基因构建的重组载体，及由所述重组载体转化获得的重组基因工程菌；所述重组载体以pet28a(+)为基础载体，优选pet28a(+)-ge01314；所述重组基因工程菌以e.coli bl21(de3)为宿主菌，优选e.coli bl21(de3)-pet28a(+)-ge01314。
8、此外，本专利技术还提供一种所述重组酰胺酶在催化外消旋酮洛芬酰胺不对称水解制备s-酮洛芬中的应用，所述的应用：将含重组酰胺酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体用ph8.0的磷酸盐缓冲液悬浮，4℃下高压匀浆破碎、离心(12000r/min离心20min)，取上清液即为粗酶液；以所述粗酶液为催化剂，以外消旋酮洛芬酰胺为底物，以二甲基亚砜(dmso)为助溶剂，以ph8.5磷酸盐缓冲液为反应介质构成反应体系，在37℃、180rpm条件下进行水解反应，反应完全后，获得含s-酮洛芬的混合液，将混合液分离纯化，获得s-酮洛芬。
9、进一步，所述反应体系中，底物加入终浓度为5-20g/l(优选10g/l)；催化剂加入量以破碎前湿菌体重量计为1-5g/l(优选1.5g/l)；助溶剂加入体积浓度为5-20％(优选10％)。
10、进一步，湿菌体悬浮于100mmol/l的ph8.0 tris-hcl缓冲液中，湿菌体用量以缓冲液体积计为10-30g/l，优选15g/l。
11、进一步，所述催化剂按如下方法制备：将含重组酰胺酶编码基因的工程菌接种于含有50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37℃、180rpm培养至菌液od600为0.5～0.8，获得种子液；然后将种子液以体积浓度1％接种量接种于含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37℃、180rpm培养3h，加入iptg至终浓度0.6mmol/l，25℃，180rpm诱导10h，离心，湿菌体悬浮于100mm的ph 8.0tris-hcl缓冲液中，在4℃下高压匀浆破碎，于4℃、10000rpm离心30min，取上清液，即为催化剂。
12、与现有技术相比，本专利技术的有益效果主要体现在：
13、本专利技术提供的重组酰胺酶与已报道的几种酰胺酶的氨基酸序列进行比对，序列一致性和相似性都很低(见本文实施例5)，且本专利技术重组酰胺酶的氨基酸序列长度更短(仅205个氨基酸)，同时酶的催化时间更短(达到～50％的底物转化率)，催化效率更高。
14、本专利技术提供的重组酰胺酶的编码基因能够在大肠杆菌中进行克隆和表达，表达的重组酰胺酶对水解外消旋酮洛芬酰胺有高的s-选择性和高活性。利用所述重组酰胺酶粗酶液催化水解底物，底物浓度10g/l，反应10h本文档来自技高网
...
【技术保护点】
1.一种来源于伯克霍尔德菌(Burkholderia sp.)的重组酰胺酶，其特征在于，所述重组酰胺酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
2.一种权利要求1所述重组酰胺酶转化获得的重组基因工程菌。
3.一种权利要求1所述重组酰胺酶在催化外消旋酮洛芬酰胺不对称水解制备S-酮洛芬中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的应用：将含重组酰胺酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体用pH8.0的磷酸盐缓冲液悬浮，4℃下高压匀浆破碎、离心，取上清液即为粗酶液；以所述粗酶液为催化剂，以外消旋酮洛芬酰胺为底物，以二甲基亚砜为助溶剂，以pH8.5磷酸盐缓冲液为反应介质构成反应体系，在37℃、180rpm条件下进行水解反应，反应完全后，获得含S-酮洛芬的混合液，将混合液分离纯化，获得S-酮洛芬。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述反应体系中，底物加入终浓度为5-20g/L；催化剂加入量以破碎前湿菌体重量计为1-5g/L；助溶剂加入体积浓度为5-20％。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，湿菌体悬浮于100mmol/L的pH8.0 Tris-HCl缓冲液中，湿菌体用量以缓冲液体积计为10-30g/L。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述催化剂按如下方法制备：将含重组酰胺酶编码基因的工程菌接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养至菌液OD600为0.5～0.8，获得种子液；然后将种子液以体积浓度1％接种量接种于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养3h，加入IPTG至终浓度0.6mmol/L，25℃，180rpm诱导10h，离心，湿菌体悬浮于100mM的pH 8.0Tris-HCl缓冲液中，在4℃下高压匀浆破碎，于4℃、10000rpm离心30min，取上清液，即为催化剂。
...
【技术特征摘要】
1.一种来源于伯克霍尔德菌(burkholderia sp.)的重组酰胺酶，其特征在于，所述重组酰胺酶的氨基酸序列为seq id no.2所示。
2.一种权利要求1所述重组酰胺酶转化获得的重组基因工程菌。
3.一种权利要求1所述重组酰胺酶在催化外消旋酮洛芬酰胺不对称水解制备s-酮洛芬中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的应用：将含重组酰胺酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体用ph8.0的磷酸盐缓冲液悬浮，4℃下高压匀浆破碎、离心，取上清液即为粗酶液；以所述粗酶液为催化剂，以外消旋酮洛芬酰胺为底物，以二甲基亚砜为助溶剂，以ph8.5磷酸盐缓冲液为反应介质构成反应体系，在37℃、180rpm条件下进行水解反应，反应完全后，获得含s-酮洛芬的混合液，将混合液分离纯化，获得s-酮洛芬。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述反应体系中，底物加入终浓度为...
【专利技术属性】
技术研发人员：张朝晖，王豪，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。