一种人TSH受体全长cDNA的细胞株及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种细胞株及其构建方法。其技术方案如下：一种人ＴＳＨ受体全长ｃＤＮＡ的细胞株，它由下列方法制得：（１）扩增ｈＴＳＨＲ基因编码区的全部序列；（２）将ｈＴＳＨＲ　ｃＤＮＡ克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体；（３）将ｈＴＳＨＲ　ｃＤＮＡ再克隆入酶ｐｃＤＮＡ３．１质粒；（４）将重组的ｐｃＤＮＡ３．１－ｈＴＳＨＲ转化菌ＤＨ５α；（５）ｐｃＤＮＡ３．１－ｈＴＳＨＲ质粒的转染ＣＨＯ细胞。本发明专利技术优点表现在：将扩增好的ｈＴＳＨＲｃＤＮＡ克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体，酶切鉴定确定是目的基因片段后再将其克隆到真核细胞表达载体ｐｃＤＮＡ３．１中，并再次进行双酶切鉴定以保证基因片段的正确性。

Human TSH receptor full length cDNA cell line and construction method thereof

The present invention relates to a cell strain and a method for constructing the same. The technical proposal is as follows: a full-length human TSH receptor cDNA cell line, which is prepared by the following method: (1) all sequence amplification of hTSHR gene encoding region; (2) hTSHR cDNA was cloned into pGEM T vector; (3) hTSHR cDNA and then cloned into the plasmid pcDNA3.1 enzyme; (4) the recombinant PcDNA3.1hTSHR transformant DH5 alpha; (5) PcDNA3.1hTSHR plasmid was transfected into CHO cells. The invention is characterized in that: the amplified hTSHRcDNA gene was cloned into pGEM T vector. Enzyme digestion is determined after the target gene fragment cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1, and again the double digestion in order to ensure the correctness of the gene fragment.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种细胞抹，尤其涉及一种人TSH受体全长cDNA的细胞 林及其构建方法。
技术介绍
促曱状腺激素(thyrotropin or thyrotrophin)又称曱状腺刺激激素 (thyroid—stimulating hormone, TSH)， 它是由垂体前叶分)必的一种重要 的糖蛋白激素，通过其特异的受体(即TSH受体)发挥促曱状腺的作用。 TSH受体是一种重要的自身抗原，其相应的自身抗体在自身免疫性甲状腺 疾病的发生过程中起着重要作用。研究发现，TRAb具有异质性有些TRAb和TSHR结合后发挥类似TSH 的作用(刺激cAMP产生、摄碘及曱状腺球蛋白合成)，称为曱状腺刺激性 抗体(thyroid stimulating antibodies, TSAb);有些TRAb同TSH受体 结合后抑制TSH介导的受体活化，称为甲状腺刺激阻断性抗体(thyroid stimulation-blocking antibody, TBAb);还有一些TRAb同TSH受体结 合后既无刺激作用也无抑制作用，称为中性TSH受体抗体(neutral TSH receptor antibodies)。 一般i人为，^口果TSH受体^元体以TSAb为主，临床上表现为Graves病；如果以TSBAb为主，临床上则表现为原发性曱状 腺功能减退症。目前临床常用的方法为Rees Smith等建立的体外竟争受体法，这种 方法是以待测血清与1251标记的TSH竟争结合TSH受体制剂，根据竟争的 强弱判断待测血清TSH受体抗体水平。用这种方法测定的TSH受体抗体也 称为TSH结合抑制免疫J求蛋白(TSH binding inhibiting immunoglobulins: TBII)。 TBII的主要缺点是只能反映抗体与TSH竟争TSH受体的能力，不 能区分抗体的功能是刺激性还是阻断性。随着人TSH受体的克隆，Vassart等将人TSH受体cDNA克隆到pSVL 真核表达载体中，并将此载体转染到CHO细胞并筛选合适的稳定表达细 胞，得到适于TSAb和TSBAb测定的细胞抹，称为JP26细胞。该JP26细 胞价格贵，不易获得，表达纯度不高，缺乏高效稳定表达。但在国内，有 文献提及原核表达载体的构建，而涉及TSHR体外真核表达系统的研究较 少，仅有一篇报道乂AA曱状腺组织中提取RNA，通过逆转录获得人TSHR 膜外区cDNA,构建了 TSHR膜外区真核表达载体并在中国仓鼠卵巢细胞表 达hTSHR膜外区蛋白分子(非全长cDNA)。由于国内缺乏高效稳定表ii^ TSH受体cDNA的细胞^朱，致使TSAb和TSBAb的测定难以开展，极大地阻 碍了AITD的诊断、治疗和研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于(1)提供一种人TSH受体全长cDNA的细胞4朱；2 )提供一种人TSH受体全长cDNA细胞林的构建方法。本专利技术的技术方案如下1、 一种人TSH受体全长cDNA的细胞4朱，它由下列方法制得 (1)用RT-PCR技术扩增hTSHR基因编码区的全部序列； (2 )将步骤(1 )得到的hTSHR cDNA克隆入pGEM-T载体，提取质粒DNA，以I / I双酶切鉴定；(3 )将步骤(2 )得到的hTSHR cDNA再克隆入酶pc應3. 1质粒； (4 )将重组的pcDNA3. 1-hTSHR转化处于感受态的大肠杆菌DH5a,质粒抽提纯化，质粒鉴定；(5 ) pcDNA3. 1-hTSHR质粒的转染CH0细胞。 其中还包括步骤(6 ):用G418筛选步骤(5 )得到的表达林。 步骤(1) PCR中所用的引物如下上游引物为:5'-cta aga ggt aCC GAG TCC CGT GGA AAA TGA-3'方框内为I酶切位点，大写部分为hTSHR cDNA特异性序列，下游引物为5'-cc|t eta ga|c gec cAA CTT ACA AAA CCG TTT GC-3' 方框内为I酶切位点，大写部分为与hTSHR cDNA互补的序列。 2、 一种人TSH受体全长cDNA的细胞4朱构建方法，包括以下步骤 (1 )用RT-PCR技术扩增hTSHR基因编码区的全部序列； (2 )将步骤(1)得到的hTSHR cDNA克隆入pGEM-T载体，提取质粒DNA，以J/w II双酶切鉴定；(3 )将步骤(2 )得到的hTSHR cDNA再克隆入酶pcDNA3. 1质粒； (4 )将重组的pcDNA3. 1-hTSHR转化处于感受态的大肠杆菌DH5ot，质粒抽提纯化，质粒鉴定；(5 ) pc廳3. 1-hTSHR质粒的转染CH0细胞。 其中还包括步骤(6 ):用G418筛选步骤(5 )得到的表达株, 步骤(1) PCR中所用的引物如下上游引物为5'—cta aga ggt aCC GAG TCC CGT GGA AAA TGA—3方框内为I酶切位点，大写部分为hTSHR cDNA特异性序列，下游引物为5'-cclt eta ga|c gec cAA CTT ACA AAA CCG TTT GC-3'方框内为J&I酶切位点，大写部分为与hTSHR cDNA互补的序列。依照上述技术方案本专利技术的具体实施方法是以人曱状腺组织cDNA为才莫板，以hTSHR基因特异的引物进行PCR扩 增，得到目的基因片段特异性条带，目的片断与pGEM-T载体连接后采用 蓝白斑法筛选阳性克隆，阳性克隆扩大培养后提取质粒DNA，以^/wI和I作双酶切，经电泳、测序鉴定得到目的基因。将经测序证实的Z/w I 和I双酶切片段连接入质粒pcDNA3. 1的A>71 /i7 a I酶切位点之间， 构建成pcDNA3. 1-hTSHR重组质粒。经转化细菌筛选阳性克隆，扩大培养， 抽4^t冲立DNA,再以《p/ I和1&2 I作双酶切，酶切产物电泳可见2300bp左 右的条带，说明目的基因已克隆入pcDNA3. 1。再对质粒DNA进行测序， 测定结果与基因库登录序列进行比对分析。测序结果显示，克隆入 pcDNA3. 1的目的片段与hTSHR基因的编码区序列完全一致，进一步证明 pcDNA3. 1-hTSHR真核表达载体已构建成功。将pcDNA3. 1-hTSHR质粒转染 CHO细胞，进行表达，用G418筛选阳性表达抹，破碎细胞，用Western 法对细胞表达蛋白进行鉴定，证明细胞可以表达hTSHR。本专利技术所公开一种人TSH受体全长cDNA的细胞林及其构建方法， 其优点表现在将扩增好的hTSHRcDNA克隆入pGEM-T载体，酶切鉴定确 定是目的基因片段后再将其克隆到真核细胞表达载体pcDNA3. 1中，并再 次进行双酶切鉴定以保证基因片段的正确性。从而完成真核表达载体的构 建。通过脂质体介导，用重组质粒pcDNA3. 1 - hTSHR转染CH0细胞，以 G418筛选稳定表达抹，经Western印记法鉴定出被转染细胞成功表达 hTSHR。 /人而得到高效稳定表达hTSHR的细胞4朱。为TSAb和TSBAb的测定 奠定了勤出，也为进一步研究人TSH受体的结构和功能打下了勤出。 附图说明图1: RT-PCR产物电泳结果(M示分子量标准；泳道1和2为RT-PCR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人ＴＳＨ受体全长ｃＤＮＡ的细胞株，它由下列方法制得：　（１）用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增ｈＴＳＨＲ基因编码区的全部序列；　（２）将步骤（１）得到的ｈＴＳＨＲ　ｃＤＮＡ克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体，提取质粒ＤＮＡ，以Ｋｐｎ　Ｉ／Ｘｂａ　Ｉ 双酶切鉴定；　（３）将步骤（２）得到的ｈＴＳＨＲ　ｃＤＮＡ再克隆入酶ｐｃＤＮＡ３．１质粒；　（４）将重组的ｐｃＤＮＡ３．１－ｈＴＳＨＲ转化处于感受态的大肠杆菌ＤＨ５α，质粒抽提纯化，质粒鉴定；　（５）ｐｃＤＮＡ３．１－ｈＴ ＳＨＲ质粒的转染ＣＨＯ细胞。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：苏青，董艳，张洪梅，冯绮文，李晓永，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属新华医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]