一种细胞因子cDNA重组反转录病毒载体的构建方法技术

本发明专利技术提供了一种细胞因子ｃＤＮＡ重组反转录病毒载体的构建方法。从经ＰＨＡ诱导的人外周血单核细胞中抽提ｍＲＮＡ，在体外合成ｃＤＮＡ，运用聚合酶链反应技术克隆了含有信号肽的白细胞介素－２　ｃＤＮＡ，并与缺陷型逆转录病毒载体ＬＸＳＮ进行重组，构建了含白细胞介素－２　ｃＤＮＡ的重组逆转录病毒载体Ｌ（ＩＬ－２）ＳＮ。

Construction method of recombinant retroviral vector of cytokine cDNA

The invention provides a method for constructing a recombinant retroviral vector of cytokine cDNA. Extraction of mRNA from PHA induced by human peripheral blood mononuclear cells, in vitro synthesis of cDNA by polymerase chain reaction and cloned interleukin - 2 peptide containing the signal peptide cDNA and defective retroviral vector LXSN was constructed by recombinant interleukin - 2 recombinant retroviral vector cDNA L SN (2).

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，更具体地，本专利技术提供了一种细胞因子cDNA 重组反转录病毒载体的构建方法。
技术介绍
原发性胃癌为我国高发的恶性肿瘤。在胃癌治疗历史上，手术切除是主要手段，但术后常复发。胃癌晚期(m期)患者，常缺乏有效的延长病人生命的治疗方 法。若这些胃癌患者经一些有效的辅助治疗措施使胃癌肿瘤縮小后，再行切除， 有可能使胃癌治疗有一个突破。90年代新兴的肿瘤基因治疗已成为肿瘤生物治疗的重要措施之一，并被誉 为继手术、化疗和放疗之后的另一种具有潜在前途的治疗方法。近年来肿瘤基因治疗的研究无论从深度上还是广度上都取得了很大进展。在获得美国重组DNA 咨询委员会(RAC)、 NIH专家委员会和FDA批准的基因治疗临床试验方案中，以 肿瘤为最多，充分显示基因治疗在肿瘤研究中的迫切性。目前所开展的肿瘤基因 治疗中，以肿瘤免疫基因治疗的研究为最多。肿瘤细胞耙向的细胞因子基因治疗 是以主动免疫治疗为基础，即将细胞因子基因转导入肿瘤细胞中，以制备出免疫 原性更强的新型瘤苗，并由于细胞因子的持续分泌，从而激发机体产生抗肿瘤免 疫反应，达到治疗肿瘤的目的。研究表明，细胞因子基因治疗不仅在一定程度上 克服了以往临床直接应用细胞因子需反复多次且副作用明显的缺点，而且也取得 了直接应用所不具有的疗效。白细胞介素-2是由活化T细胞所分泌的一种细胞因子，具有刺激多种免疫 效应细胞活化的作用，包括T细胞、B细胞、NK细胞和巨噬细胞等。在肿瘤免疫 中起到重要作用。十多年前已开始将重组白细胞介素-2应用于临床恶性肿瘤病 人。这种白细胞介素-2的系统性应用在黑色素瘤及其它一些肿瘤病人中取得一 定的效果，报道有效率为15 20%。这种疗法主要是基于白细胞介素-2可使T细胞活化，从而有助于杀伤肿瘤细胞。然而由于白细胞介素-2在血液中的半衰期 较短，而反复多次大剂量的应用又产生严重的毒副作用，因而限制了白细胞介素 -2的临床应用。本专利技术提供了，为癌 症的治疗提供了一种新的治疗途径。
技术实现思路
本专利技术提供了。包括 mRNA的抽提及cDNA的合成、PCR扩增IL-2基因、IL-2 cDNA的克隆、 含IL-2重组逆转录病毒载体的组建。在本专利技术的第一方面，提供了一种含信号肽的白细胞介素-2 cDNA。 在本专利技术的第二方面，提供了一种含IL-2重组逆转录病毒载体的组建方法。附图说明无。具体实施例方式第一步含信号肽的白细胞介素-2 cDNA的制备。1. PHA剌激的人外周血细胞人外周血用淋巴细胞分离液分离出单 个核细胞，共约lxl(^细胞，经植物血凝素(PHA)l(Vg/ml剌激30小时， 使细胞因子基因表达，以备抽提mRNA。2. mRNA的抽提及cDNA的合成(1) mRNA的抽提离心收集细胞，悬浮于1.5mlRNA抽提缓冲液， 用注射器反复抽打匀浆细胞，然后再补加3ml抽提缓冲液，充分混合，离 心1000 cpm5分钟，收集上清。取Oligo (dT)-Cellulose Spun Column,混 合内容物，350g离心两分钟，弃去柱内液体，取4ml上清上柱，混匀，弃 去液体。然后用高盐缓冲液洗三遍，低盐缓冲液洗二遍，最后用经65°C预 热的洗脱缓冲液洗脱三次，每次用0.25ml，收集洗脱液，然后乙醇沉淀 poly(A)十RNA(mRNA)。(2)cDNA的合成将mRNA溶于20nl ddH20中，65°C10分钟，置于 冰上备用。在第一条链反应混合液内加入lmlDTT和热变性的RNA， 37 。C保温1小时，再将此反应液加入第二条链反应混合液中，12°C和22" 各保温1小时，最后加lpl Klenow酶，37°C 30分钟，65°C10分钟后再 用酚和氯仿抽提，经Sephacryl S-300柱纯化后-20匸保存。2. PCR扩增IL-2基因取制备好的PBLcDNA10pl，加入5'和3'扩 增引物各lpl( 30pmo1)、 IOX反应缓冲液5^1、 dNTP4pl、加水至50|iil， 94°C 5分钟变性，力卩Pfu酶1U(2.5U)，进行30个循环反应.(94。C 45"、 55TM5"、 72'C1'20")。反应结束后，将反应产物用等体积苯酚/氯仿抽提一 次，乙醇沉淀。3. IL-2 cDNA的克隆为了鉴定PCR产物的准确性，须先将产物克 隆入pUC18或pBluescriptDNA， 经DNA序列测定确认为IL-2 cDNA无 误后再将这一片段回收，并与表达载体重组。故将PCR产物溶于TE，用 适当的限制性内切酶水解后，与用同样酶水解过的载体DNA重组，转化 TG1后涂于LB/AP平板，37t:培养过夜。4. 质粒DNA小量抽提将一个单菌落接入含AP(50iag/ml)的3ml LB 中，37。C培养过夜。将菌液转移至1.5ml离心管中，5000rpm离心2分钟， 沉淀菌体。用lOOial溶液I悬浮菌体，再加200lal溶液II ，温和颠倒混匀， 置于冰上，待溶液澄清后，加入150^1溶液m，充分混匀。15000rpm 10 分钟离心，收集上清，用等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，加2.5倍乙 醇混匀，沉淀。离心15000rpm 10分钟，将沉淀用70%乙醇洗一次，水 泵抽干，最后溶于20^ilTE，用200pg/mlRNase处理1小时，-20°<:存放。5. 质粒DNA的大量抽提(1) 接种培养将一个单菌落接种于3mlLB(含AP)中培养至对数晚期 (OD600"0.6)，取500|nl接种入50ml含抗菌素的LB中，同样培养至对数 晚期，再取15ml接种入含相应抗菌素的1.5LLB中，培养过夜。(2) 质粒抽提将1.5L培养物离心5500rpml0分钟，收集菌体。用吸 水纸将离心管壁上残余液体擦干。将菌体悬浮于30ml溶液I中，置室温中 IO分钟。加液-体II60ml，混合均匀后置冰上10分钟。加溶液IIl45ml，置冰浴IO分钟后，15000rpm离心IO分钟。纱布过滤后取上清，加等体积异 丙醇沉淀，15000rpm离心10分钟，用70%乙醇洗一次，真空干燥。将沉 淀溶于20mlTE，加入等体积5M LiCl沉淀大分子RNA，在水浴中放置 IO分钟，4°Cl5,000rpm离心10分钟，取上清，用等体积异丙醇沉淀。离 心，干燥，溶于5mlTE，加入RNase至200叫/ml， 37°C 30分钟。加等体 积13%PEG(8000)/1.6M NaCl沉淀DNA，冰浴放30分钟。离心沉淀，干 燥后用TE5ml溶解，用苯酚、苯酚/氯仿/异戊醇、氯仿/异戊醇各抽提一 次。最后加1/10体积3MNaAc及2倍乙醇沉淀。-20匸保存。用时再 离心沉淀，溶于TE。(3) CsCl超离心纯化DNA: 如上述碱法抽提的DNA，经LiCl纯 化后，用于CsCl超速离心，按lg/ml的用量，加入固体CsCl， 3(TC溶解。 每10mlDNA加入0.8ml溴乙锭溶液(10mg/ml)， CsC溶液的最终密度是 1.55g/ml，折射率1.3860，溴化乙锭浓度约为704^g /ml。室温8000rpm 5 分钟，浮在溶液上的是溴化乙锭和蛋白质形成的复合物。将浮渣下的清亮 溶液用注射器吸入用于超离心的离心管中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
细胞因子ｃＤＮＡ重组反转录病毒载体的构建方法，其特征在于，该反转录病毒载体ｃＤＮＡ为含信号肽的白细胞介素－２　ｃＤＮＡ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈诗书，钱关祥，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院，上海新生源医药研究有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]