【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及药物有效成分筛选，具体涉及一种基于干细胞的神经保护药物筛选模型及其构建方法和应用。
技术介绍
1、人们在长期寻找药物的实践过程中，建立了大量用于新药筛选的各类模型，动物筛选模型以动物作为药物筛选的观察对象，通过动物对药物的反应，证明某些物质的药理作用，评价其药用价值。可以从动物身上直观地反应出药物的治疗效果、不良反应以及毒副作用，模型可以选择健康动物，也可以是疾病动物，为了更加准确和充分的反映出药物在相关疾病的治疗作用，一般采用病理机理与人类病症相似的动物疾病模型进行实验观察，确保药物发挥作用的稳定性及安全性，现如今，国内外已经成功掌握了利用不同种类动物构建不同疾病的动物模型，由于整体动物实验的特殊性，实验受操作者的主观性及操作能力的影响较大，并且所能进行的筛选药物有限，尤其是不能在动物身上模拟的人类疾病也较多，使得利用动物模型进行药物筛选具有效率低、成本高等局限性。组织器官筛选模型即将待测样品加入到离体的组织器官中，观察药物作用，来判断药物所具有的活性。可以通过组织器官模型观察生理条件下药物的作用，将组织器官制成所需的疾病模型，观察样品对病理条件下的组织器官所发挥的作用，组织器官筛选极大的减少所用样本的数量，缩短筛选、扩大单次样品筛选数量，减少动物使用量，在一定程度上弥补动物筛选模型的不足，降低成本、提高效率。但是，由于其规模小、效率低、反应药物作用有限、不易实现一药多筛。此外，依旧受实验操作者主观能力影响，并且也无法完美的模拟实际病理过程。
2、细胞和分子药物筛选模型，是目前使用最广泛的筛选模型，其
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种基于干细胞的神经保护药物筛选模型及其构建方法，以解决现有中药材活性成分含量低，筛选成本高周期长的问题。
2、本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种基于干细胞的神经保护药物筛选模型的构建方法，包括以下步骤：
3、(1)以神经生长因子ngf为启动子，合成目的基因，连接荧光素酶报告基因，构建含有荧光素酶报告基因的质粒载体，慢病毒转染入宿主细胞，建立可进行神经保护药物筛选的稳定细胞株；
4、(2)分别采用阳性药物对步骤(1)建立的可进行神经保护药物筛选的稳定细胞株进行刺激，当相对荧光素酶表达≥150％时，确定所述阳性药物可成功启动ngf，即得到活性单体；
5、(3)将步骤(2)得到的活性单体进行骨髓间充质干细胞定向诱导验证，得到确定具有神经保护作用的活性单体；
6、(4)采用大鼠脑卒中后抑郁模型，对步骤(3)得到的确定具有神经保护作用活性单体进行体内药效学验证，确认所述活性单体能对大鼠发挥神经保护作用，即得到基于干细胞的神经保护药物筛选模型。
7、在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进：
8、进一步，步骤(1)中，宿主细胞为293t细胞。
9、进一步，步骤(1)中，通过挑选单克隆抗体进行扩大培养，并通过qpcr进行荧光素酶表达验证，建立可进行神经保护药物筛选的稳定细胞株。
10、进一步，步骤(2)中，将阳性药物采用培养液稀释为浓度为1-15μmol/l，然后和步骤(1)建立的可进行神经保护药物筛选的稳定细胞株进行共培养，完成刺激过程。
11、进一步，步骤(2)中，阳性药物为何首乌单体成分大黄素、大黄酚、大黄酸、二苯乙烯苷、虎杖苷、没食子酸、胡萝卜苷和芦丁。
12、进一步，步骤(2)中，em、大黄酸及大黄酚稀释的浓度均为8μmol/l。
13、进一步，步骤(2)中，tsg、pd、没食子酸和胡萝卜苷稀释的浓度均为10μmol/l。
14、进一步，步骤(2)中，芦丁稀释的浓度为6μmol/l。
15、进一步，步骤(3)中，当活性单体能刺激骨髓间充质干细胞分泌脑源性神经营养因子和神经生长因子时，活性单体为确定具有神经保护作用的活性单体。
16、进一步，步骤(3)中，通过蛋白免疫印迹、酶联免疫吸附和实时荧光定量pcr进行骨髓间充质干细胞定向诱导验证。
17、进一步，步骤(4)中，通过免疫组化、酶联免疫吸附及蛋白免疫印迹检测各组大鼠脑组织中神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经生长因子3的蛋白表达，确认所述活性单体能发挥神经保护作用。
18、本专利技术还提供上述构建方法构建的基于干细胞的神经保护药物筛选模型。
19、本专利技术还提供上述药物筛选模型在筛选神经保护药物方面的应用。
20、本专利技术具有以下有益效果：
21、1、利用骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，bmscs)可塑性强，灵敏度高，易于提取分离，可在适宜条件下诱导分泌神经营养因子等特性，本专利技术建立了“高通量定向筛选+骨髓间充质干细胞靶向诱导”药物筛选模型，以确定何首乌中发挥神经保护活性的主要单体成分，并通过体内药效学进行准确性验证。在此基础上，对em治疗psd的作用机制进行探究，试图寻找脑卒中与psd治疗过程中的联系。
22、2、本专利技术成功构建具有筛选神经保护活性成分的筛选模型，对何首乌的主要单体成分进行筛选后发现，em、tsg及pd可以成功启动ngf启动子，进行高表达。对筛选后的活性单体进行干细胞定向诱导及体内验证后发现，3个单体成分均具有刺激干细胞分泌神经营养因子及改善psd大鼠神经及行为学功能，促进脑组织结构恢复及提高脑组织神经营养因子蛋白表达的作用。并且在发现大黄素有较好的治疗效果后，进一步发现大黄素可以抑制水通道蛋白表达，减少脑缺血后水进入细胞，改善细胞肿胀，治疗缺血性脑水肿，对psd大鼠发挥双重治疗作用。
23、3、本专利技术的简捷快速的筛选微量成分生物活性的模型，能够解决中药材成分复杂，微量成分众多、药效成分不明、作用机制不清、质量控制指标与临床功效成分脱离等难题。
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1.一种基于干细胞的神经保护药物筛选模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于干细胞的神经保护药物筛选模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，宿主细胞为293T细胞。
3.根据权利要求1所述的基于干细胞的神经保护药物筛选模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，通过挑选单克隆抗体进行扩大培养，并通过qPCR进行荧光素酶表达验证，建立可进行神经保护药物筛选的稳定细胞株。
4.根据权利要求1所述的基于干细胞的神经保护药物筛选模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，将阳性药物采用培养液稀释浓度为1-15μmol/L，然后和步骤(1)建立的可进行神经保护药物筛选的稳定细胞株进行共培养，完成刺激过程。
5.根据权利要求1所述的基于干细胞的神经保护药物筛选模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，阳性药物为何首乌单体成分大黄素、大黄酚、大黄酸、二苯乙烯苷、虎杖苷、没食子酸、胡萝卜苷和芦丁。
6.根据权利要求1所述的基于干细胞的神经保护药物筛选模型的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，当活性单体能刺激
7.根据权利要求1所述的基于干细胞的神经保护药物筛选模型的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，通过蛋白免疫印迹、酶联免疫吸附和实时荧光定量PCR进行骨髓间充质干细胞定向诱导验证。
8.根据权利要求1所述的基于干细胞的神经保护药物筛选模型的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，通过免疫组化、酶联免疫吸附及蛋白免疫印迹检测各组大鼠脑组织中神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经生长因子3的蛋白表达，确认所述活性单体能发挥神经保护作用。
9.权利要求1-8任一项所述的基于干细胞的神经保护药物筛选模型的构建方法构建的基于干细胞的神经保护药物筛选模型。
10.权利要求9所述的基于干细胞的神经保护药物筛选模型在筛选神经保护药物方面的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基于干细胞的神经保护药物筛选模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于干细胞的神经保护药物筛选模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，宿主细胞为293t细胞。
3.根据权利要求1所述的基于干细胞的神经保护药物筛选模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，通过挑选单克隆抗体进行扩大培养，并通过qpcr进行荧光素酶表达验证，建立可进行神经保护药物筛选的稳定细胞株。
4.根据权利要求1所述的基于干细胞的神经保护药物筛选模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，将阳性药物采用培养液稀释浓度为1-15μmol/l，然后和步骤(1)建立的可进行神经保护药物筛选的稳定细胞株进行共培养，完成刺激过程。
5.根据权利要求1所述的基于干细胞的神经保护药物筛选模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，阳性药物为何首乌单体成分大黄素、大黄酚、大黄酸、二苯乙烯苷、虎杖苷、没食子酸、胡萝卜苷和芦丁。
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