【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体的，本专利技术涉及一种将人多能干细胞诱导分化为胰腺前体细胞的方法。
技术介绍
1、糖尿病，一种以持续高血糖为标志的全球性慢性疾病，主要由胰岛素分泌不足或对胰岛素的抵抗引起。长期的高血糖环境可能导致包括心脏、血管、肾脏、眼睛和神经在内的多种组织受损和功能障碍。目前的治疗策略，如外源性胰岛素注射和胰岛细胞移植，虽能缓解糖尿病症状，但存在准确性不足、低血糖风险和供体细胞短缺等问题。随着干细胞技术的发展，特别是通过体外定向分化技术从人类多能干细胞(如人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞)获得具有分泌胰岛素能力的β样细胞和类胰岛结构的策略，为糖尿病提供了新的治疗可能。
2、从人多能干细胞(包括人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞)起始，通过添加小分子和重组蛋白调节信号通路模仿体内胰腺谱系的发育过程，最终获得包含分泌胰岛素的β样细胞的类胰岛组织。目前普遍认为这一过程主要是通过逐步诱导为定型内胚层(definitive endoderm，de)、原始肠管(primitive gut tube，pgt)、后前肠(posteriorforegut，pf)，胰腺内胚层(pancreatic endoderm，pe)或胰腺前体细胞(pancreaticprogenitor，pp)以及内分泌前体细胞(endocrine progenitor，ep)，最终获得包含β样细胞的类胰岛组织。其中诱导出优质的胰腺前体细胞对于后续内分泌细胞的分化效率和功能是至关重要的。由于目前对人类胰腺发育的了解有限，定向分化的线索主要来自于动物模型，特别
3、目前现有方案通过逐步利用不同小分子化合物组合和处理顺序，以及不同的培养时长，在一定程度上获得了表达pp细胞特征基因pdx1和nkx6-1的诱导细胞，并在此基础上获得一定比例且具有一定功能的β样细胞，但同时也会产生较高比例的多激素细胞(胰岛素和胰高血糖素共表达)或α样细胞(分泌胰高血糖素)。造成当前诱导方案分化效率和纯度有限的主要原因是对于人体胰腺谱系分化过程的理解不够完全，缺少单细胞水平上的基于体内分化过程对体外分化路径和诱导细胞状态的系统评价，欠佳的早期分化流程和pp细胞状态可能是导致后续分化问题的原因之一。
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的问题，本专利技术深入分析了小鼠和人类胰腺发育的过程，发现发育路径具有物种间的保守性但在调控网络上具有一定的特异性。从发育路径上看，胰腺前体细胞pp具有腹侧和背侧胰腺内胚层(vpe和dpe)两个起源，分别从de细胞经历胰腺分化命运的al细胞(al-p)和胰腺分化命运的mg细胞(mg-p)而来。比较人类和小鼠的pp细胞发育路径发现，在人类中，腹侧路径(al-p和vpe)与pp细胞的相似性超过背侧路径(mg-p和dpe)，这表明了更高的分化效率，而小鼠中这一现象不明显。通过基因共表达网络分析进一步确认了，从de到内分泌谱系的精细分化过程包含三个关键基因模块，其中pp细胞处在连接前两个模块的关键位置。
2、专利技术人随后对现有诱导方案过程进行全局的单细胞水平解析，鉴定了现有方案的细胞性质、分化路径和调控网络。通过与体内细胞分化过程进行比较，专利技术人发现与体内不同的主要两点：一是未建立稳定的类似体内发育的基因共表达网络。当前体外从de到内分泌细胞的分化过程分为四个基因模块，而非体内的三个模块，其中早期的基因模块并未稳定的建立。二是现有方案中pp细胞的形成未能模拟人体内腹侧分化路径的高效过程，导致转化为pp细胞的过渡状态与人体内al-p细胞相似度不足。
3、鉴于此，本专利技术提出了一种改进的方法：通过延长s2阶段的诱导时长，促进早期基因网络的形成，并仿照人类胚胎发育中腹侧胰腺内胚层向pp细胞的自然转化过程(de–al-p–vpe–pp)，通过加入特定信号物质激活tgf-βnodal通路(添加activin a)和wnt通路(添加chir-99021)，促进al-p状态细胞的生成。在此基础上，可以将对照方法的s3和s4诱导时期进行简并，并降低fgf10的使用浓度，实现pp细胞质量的提高。在不改变对照方法s5和s6诱导方案的条件下仍可显著提升β样细胞比例，降低多激素或α样细胞比例。对诱导不同时期移植到动物体内的类胰岛进行分析表明，对照方法最后一个诱导阶段(s7)在本流程中可以省略，使得整个诱导过程缩短至19天的5个阶段，移植后的类胰岛能有效维持血糖稳定。
4、具体的，本专利技术提供如下的技术方案：
5、本专利技术的第一个方面，提供一种将人多能干细胞诱导分化为胰腺前体细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
6、s1：同时激活tgf-βnodal通路和wnt通路；
7、s2：同时激活fgf通路、tgf-βnodal通路、wnt通路和添加终浓度0.25mm维生素c；
8、s3：同时激活fgf通路、抑制shh通路、激活retinoic acid(ra)通路、抑制bmp通路、激活pkc和添加终浓度0.25mm维生素c；
9、s4：同时抑制shh通路、激活retinoic acid(ra)通路、抑制bmp通路、抑制tgf-βri激酶和添加终浓度1μm甲状腺素t3；
10、s5：同时抑制bmp通路、激活notch通路、抑制tgf-βri激酶和添加终浓度1μm甲状腺素t3。
11、在一种实施方式中，所述方法的步骤具体为：
12、将人多能干细胞培养在添加终浓度10μm y-27632的mtesr1多能干细胞培养基中，24小时后起始诱导分化：
13、s1历时2天：在培养基中添加终浓度100ng/ml activin a和chir-99021，第一天使用终浓度3μm，第二天使用终浓度0.3μm；
14、s2历时4天：在培养基中添加终浓度50ng/ml fgf10、10ng/ml activin a、0.3μmchir-99021和0.25mm维生素c；
15、s3历时3天：在培养基中添加终浓度2ng/ml fgf10、0.25μm sant-1、1μm ra、100nmldn-193189、200nm tppb和0.25mm维生素c；
16、s4历时3天：在培养基中添加终浓度0.25μm sant-1、0.05μm ra、100nm ldn-193189、10μm alk5i ii、1μm甲状腺素t3；
17、s5历时7天：在培养基中添加终浓度100nm ldn-193189、100nm gsixx、10μmalk5iii、1μm甲状腺素t3；
18、其中，s1和s2中所用的基础培养基为mcdb本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种将人多能干细胞诱导分化为胰腺前体细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤(S)：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述各步骤具体操作为：
3.如权利要求2所述的方法在诱导类胰岛组织中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：
5.一种评估体外细胞分化过程的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
【技术特征摘要】
1.一种将人多能干细胞诱导分化为胰腺前体细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤(s)：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述各步骤具体操作为：
3.如权利要求2...
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