【技术实现步骤摘要】
本申请涉及生物，尤其涉及一种基于crispr/dcas9的电化学生物传感器及其在线粒体dna检测中的应用。
技术介绍
1、线粒体dna(mtdna)作为细胞内唯一的细胞外遗传物质已被证明是完全由母体遗传的。线粒体对活性氧氧化损伤的敏感性及有限的修复和保护能力导致mtdna的高突变率和由此产生的大变异并存，这种现象被称为异质性。
2、由mtdna突变引起的异质性可引发多种人类疾病，包括肾衰竭、心脏病、糖尿病、癌症、身材矮小等。park等人报道了携带异质mtdna突变的细胞系表现出显著增强的肿瘤生长。因此，快速、高选择性、高灵敏度检测mtdna基因突变特别是单核苷酸变异(snv)的能力对于mtdna突变相关疾病的早期诊断和鉴定至关重要。传统的测序方法费时耗力，价钱昂贵。现有无需测序的方法如变性高效液相色谱法及限制性片段长度多态性检测方法等都存在相应的问题，如需要昂贵且精密的仪器，易出现假阳性等。
技术实现思路
1、有鉴于此，本申请的目的在于提供一种基于crispr/dcas9的电化学生物传感器，使其能够方便快捷的定性、定量检测mtdna的突变情况，并具有较高的选择性和灵敏度；
2、本申请的另外一个目的在于提供基于上述电化学生物传感器在mtdna检测中的相关应用，包括但不限于制备产品和检测样本。
3、为了解决上述技术问题/达到上述目的或者至少部分地解决上述技术问题/达到上述目的，作为本申请的第一个方面，提供了一种基于crispr/dcas9的电化学生物
4、所述工作电极为导电玻璃，所述导电玻璃上偶联有dcas9-sgrna复合物，所述sgrna根据野生型mtdna靶标依据crispr原理设计；所述hcr反应试剂包括发卡探针h1和发卡探针h2，所述野生型mtdna靶标作为hcr反应的引发链，所述发卡探针h1和发卡探针h2根据所述野生型mtdna靶标进行设计。
5、可选地，所述野生型mtdna靶标为mtdna的nd5基因。
6、进一步可选地，所述野生型mtdna靶标为如seq id no.1和seq id no.2所示的dsdna，所述sgrna为如seq id no.3所示的单核苷酸，所述发卡探针h1为如seq id no.4所示的单链核苷酸，所述发卡探针h2为序列如seq id no.5所示的单链核苷酸。
7、可选地，所述dcas9-sgrna复合物由dcas9蛋白和sgrna孵育后形成。
8、可选地，还包括电化学工作站。
9、作为本申请的第二个方面，提供了所述的电化学生物传感器的制备方法，包括：制备工作电极，所述工作电极与hcr反应试剂、聚乙烯亚胺-银纳米粒子、参比电极、对电极以及电解液组成电化学生物传感器；
10、所述工作电极制备过程包括：
11、s1.导电玻璃的表面活化乙基修饰；
12、s2.dcas9-sgrna复合物偶联在修饰后的导电玻璃表面。
13、作为本申请的第三个方面，提供了所述的电化学生物传感器在制备检测mtdna的产品或在检测mtdna中的应用。
14、作为本申请的第四个方面，提供了一种非诊断目的检测mtdna的方法，包括：
15、将野生型mtdna对照样本与本申请所述工作电极孵育，清洗工作电极并干燥，然后加入本申请所述hcr反应试剂进行反应，反应后清洗工作电极并干燥，然后将工作电极置于聚乙烯亚胺-银纳米粒子溶液中浸泡，浸泡后清洗；
16、将清洗后的工作电极与参比电极、对电极一起浸入电解质溶液中进行电化学检测，获得阻抗差值△r对照；
17、将待测样本进行相同的电化学检测，获得阻抗差值△r检测，若所述阻抗值差△r对照与△r检测有显著性差异，则说明待测样本存在mtdna突变。
18、作为本申请的第五个方面，提供了一种非诊断目的检测mtdna的方法，包括：
19、设置梯度浓度的mtdna靶标样本；
20、将所述mtdna靶标样本与本申请所述工作电极孵育，清洗工作电极并干燥，然后加入本申请所述hcr反应试剂进行反应，反应后清洗工作电极并干燥，然后将工作电极置于聚乙烯亚胺-银纳米粒子溶液中浸泡，浸泡后清洗；
21、将清洗后的工作电极与参比电极、对电极一起浸入电解质溶液中进行电化学检测，以mtdna靶标样本浓度及其对应的阻抗值r标准为坐标，得到阻抗值r标准随mtdna靶标样本浓度变化的曲线；
22、在曲线上找到具有线性变化规律的点，进行线性拟合，获得mtdna靶标样本浓度-阻抗值r标准的标准曲线；
23、将待测样本按照同样的电化学检测方法进行电化学检测，将所获得的阻抗值r检测代入到所述标准曲线中，获得待测样本线粒体中mtdna靶标的含量。
24、本申请借助crispr原理，以dcas9-sgrna复合物作为识别分子修饰在工作电极表面特异性捕获目标dna，释放目标dna的非结合链作为引发链发生hcr反应，在工作电极表面引发了发夹自组装产生dsdna聚合物；聚乙烯亚胺-银纳米粒子沉积在dsdna聚合物骨架上加速电子转移速率，从而显著放大电化学信号，实现了目标物的灵敏、快速和特异检测。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种基于CRISPR/dCas9的电化学生物传感器，其特征在于，包括工作电极、HCR反应试剂、聚乙烯亚胺-银纳米粒子、参比电极、对电极和电解液；
2.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述野生型mtDNA靶标为mtDNA的ND5基因。
3.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述野生型mtDNA靶标为如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的dsDNA，所述sgRNA为如SEQ ID No.3所示的单核苷酸，所述发卡探针H1为如SEQ IDNo.4所示的单链核苷酸，所述发卡探针H2为序列如SEQ ID No.5所示的单链核苷酸。
4.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述dCas9-sgRNA复合物由dCas9蛋白和sgRNA孵育后形成。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的电化学生物传感器，其特征在于，还包括电化学工作站。
6.权利要求1所述的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括：制备工作电极，所述工作电极与HCR反应试剂、聚乙烯亚胺-银纳米粒子、参
7.权利要求1-5任意一项所述的电化学生物传感器在制备检测mtDNA的产品或在检测mtDNA中的应用。
8.一种非诊断目的检测mtDNA的方法，其特征在于，包括：
9.一种非诊断目的检测mtDNA的方法，其特征在于，包括：
...【技术特征摘要】
1.一种基于crispr/dcas9的电化学生物传感器，其特征在于，包括工作电极、hcr反应试剂、聚乙烯亚胺-银纳米粒子、参比电极、对电极和电解液；
2.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述野生型mtdna靶标为mtdna的nd5基因。
3.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征在于，所述野生型mtdna靶标为如seq id no.1和seq id no.2所示的dsdna，所述sgrna为如seq id no.3所示的单核苷酸，所述发卡探针h1为如seq idno.4所示的单链核苷酸，所述发卡探针h2为序列如seq id no.5所示的单链核苷酸。
4.根据权利要求1所述的电化学生...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。