CIDE-A基因CpG启动子序列及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种ＣＩＤＥ－Ａ基因ＣｐＧ启动子序列及其应用，所述的ＣＩＤＥ－Ａ基因ＣｐＧ启动子是具有指导目的基因表达功能的核酸，其具有ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：１中（１－１４２０）～１５４４位所示的核苷酸序列。本发明专利技术还公开了新的受到ＤＮＡ甲基化调控的启动子核心序列。本发明专利技术还公开了可极好地用于检测待测核酸中细胞凋亡诱导ＤＥＦ４５样因子Ａ（ＣＩＤＥ－Ａ）基因启动子甲基化模式的试剂，并且还优化了检测的方法。

CIDE-A gene CpG promoter sequence and uses thereof

The invention belongs to the field of biotechnology, discloses a CIDE A CpG gene promoter sequence and its application, CIDE CpG of the A gene promoter is a guide gene expression function of nucleic acid, which has SEQID NO:1 (1 - 1420) ~ 1544 nucleotide sequence shown. The invention also discloses a new promoter core sequence regulated by DNA methylation. The invention also discloses means for detecting cell apoptosis induced by DEF45 nucleic acids like factor A can be a good (CIDE A) gene promoter methylation patterns of the reagent, and the detection method for optimization.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，更具体地，本专利技术涉及细胞凋亡诱导DEF45样 因子A (CIDE-A)基因CpG启动子序列及其应用。
技术介绍
DNA甲基化是 一 种表观遗传修饰，它是由DNA甲基转移酶(DNA methyl-transferase, Dnmt)催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶核 苷酸的嘧啶环第5位碳原子甲基化，并与其3'端的鸟嘌呤形成甲基化的CpG (mCpG)，且在双链中对称出现。在真核生物DNA中，CG二核苷酸是最主要的甲 基化位点，通常基因组70 90%的CpG序列发生这种甲基化修饰。在这样的序 列中，胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的总和超过四种碱基总和的50%，这种富含CpG 序列的DNA片段被称为CpG岛。人类约50%基因的5'端可发现CpG岛，CpG岛 占总DNA的1%左右。近年来，研究者不断探索定性及定量检测单个或多个甲基化位点的方法，但由于甲基化多态性区域存在的密度很高，所以对于延伸反应其引物的位置很 难设计。随着人们生活水平的提高和饮食结构的变化，肥胖病的发病率也有逐年增 高的趋势，肥胖可增加患糖尿病、高血压和心血管疾病的危险。根据流行病学 统计，肥胖发生率的增加与成年人群死亡率的增加呈高度相关，不论国内国外， 肥胖病都已成为当前最广泛的严重威胁人类健康的疾病之一。现在研究己经发 现在肥胖病人中存在一系列的基因表达失调的情况，而引起这种改变的重要机 制之一就是基因启动子区域DNA甲基化修饰作用，该区域的DNA甲基化程度影 响着基因的表达水平。CIDE-A是一类新发现的具有诱导细胞死亡作用的蛋白家 族成员之一，在脂肪组织中存在特异性的高表达。CIDE-A可以诱导细胞凋亡， 其凋亡诱导活性可以被DFF45抑制。鼠源CIDE-A可以与解偶联蛋白l(UCPl) 相互作用，它可能是通过直接抑制UCP1的活性来调控脂肪水解、肥胖和热量产生。人的CIDE-A在肥胖人群中的表达水平要低于正常人群，而且受到TNF-a信号通路的负调，在脂肪的合成和代谢中发挥重要作用，提示CIDE-A基因 的表达沉默或下调可能是肥胖发生的机制之一，也是一个潜在的治疗肥胖的作 用靶点。随着人们对DNA甲基化在疾病发生相关基因表达过程中所发挥的作用的日 益重视，对各类疾病发生相关基因的DNA甲基化分析已成为当前疾病基因治疗 研究的热点，而肥胖日益成为危及健康的重大疾病，因此本领域迫切要求研究 相关发生基因的DNA甲基化状态，并在此基础上开发敏感有效的诊断与治疗的 方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种来源于细胞凋亡诱导DEF45样因子A(CIDE-A)启动子区域的启动子及其用途。本专利技术的另一目的在于提供含有所述启动子的表达载体以及宿主细胞。 本专利技术的另一 目的在于提供一种检测待测核酸中细胞凋亡诱导DEF45样因子A基因启动子甲基化模式的方法；以及检测试剂或检测试剂盒。在本专利技术的第一方面，提供一种分离的核酸，所述的核酸序列选自下组(1) 由SEQ ID N0: 1中(1-1420) 1544位所示的核苷酸序列构成；(2) 具有SEQ ID NO: 1中(1-1420) 1544位所示的核苷酸序列且具有指 导目的基因(如细胞凋亡诱导DEF45样因子A， CIDE-A)转录或表达功能的核苷 酸序列；(3) 在严格条件下能够与(1)或(2)限定的核苷酸序列杂交且具有指导目的 基因转录或表达功能的核苷酸序列；(4) 与(1)或(2)限定的核苷酸序列有70%以上相同性且具有指导目的基因转录或表达功能的核苷酸序列；或(5) 与(1)-(4)任一限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列。 在另一优选例中，所述的核酸序列选自下组具有SEQ ID NO: 1中1420 1544位序列(对应于CIDE-A翻译起始位点上 游-137/-13);具有SEQ ID NO: 1中1361 1544位序列(对应于CIDE-A翻译起始位点上<table>table see original document page 6</column></row><table>在本专利技术的第二方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的核酸，作为 启动子元件。在另一优选例中，所述的载体还含有与所述的核酸可操作地连接的目的基因。在另一优选例中，所述的目的基因是外源基因。在另一优选例中，所述的目的基因包括(但不限于)CIDE-A基因、荧光素 酶基因、绿色荧光蛋白基因。在另一优选例中，所述的目的基因序列位于所述核酸序列的下游，且是与 所述的核酸序列直接邻近的编码基因的序列。通常，所述的核酸序列与目的基 因序列的间隔小于500bp(优选的，小于200bp;更优选的，小于100bp;最优选 的，小于50bp)。在本专利技术的第三方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述的细胞含有所述的载体；或 其基因组中整合有外源的所述的核酸。在本专利技术的第四方面，提供一种检测待测核酸中细胞凋亡诱导DEF45样因 子A基因启动子甲基化模式的方法，所述方法包括(1) 应用使非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的试剂处理待测核酸；(2) 用细胞凋亡诱导DEF45样因子A基因启动子CpG岛的特异性引物从(1)的待测核酸中扩增细胞凋亡诱导DEF45样因子A基因启动子CpG岛； (3)应用限制性内切酶Hhal来酶切(2)的扩增产物；若所述扩增产物能够被Hhal酶切，则说明细胞凋亡诱导DEF45样因子A基因启动子为甲基化模式；若所述扩增产物不能被Hhal酶切，则说明细胞凋亡诱导DEF45样因子A基因启动子为非甲基化模式。在另一优选例中，所述的待测核酸是经过适当酶切加工的基因组DNA,如经EcoRI和BglII酶切的基因组DNA产物。在另一优选例中，所述的细胞凋亡诱导DEF45样因子A基因启动子CpG岛的特异性引物具有SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3所示的序列。在另一优选例中，利用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR产物是否被酶切； 若产生约580bp的条带，则说明PCR产物未被HhaI酶切； 若产生约200bp和90bp的条带，则说明PCR产物被Hhal酶切。 在另一优选例中，所述的使非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的试剂是亚硫酸氢盐。在另一优选例中，所述的亚硫酸氢盐是亚硫酸氢钠。更优选的，所述的试 剂还包括对苯二酚和/或氢氧化钠。在本专利技术的第五方面，提供一种限制性内切酶Hhal的用途，用于制备检 测细胞凋亡诱导DEF45样因子A基因启动子甲基化模式的试剂盒。在本专利技术的第六方面，提供一种用于检测待测核酸中细胞凋亡诱导DEF45 样因子A基因启动子甲基化模式的试剂盒，所述试剂盒含有限制性内切酶HhaI;特异性扩增细胞凋亡诱导DEF45样因子A基因启动子CpG岛的引物；和 使非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的试剂。在另一优选例中，所述的试剂盒中还包含阳性对照和/或阴性对照。 本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。附图说明图1显示人源CIDE-A基因CpG启动子的核心序列。图2显示不同长度的人源CIDE-A基因CpG启动子片段在Hela和HEK-293T细胞株中活性检测。图3显示使用甲基化敏感性限制性内切酶检测不同细胞株中CIDE-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的核酸，其特征在于，所述的核酸序列选自下组：　（１）由ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１中（１－１４２０）～１５４４位所示的核苷酸序列构成；　（２）具有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１中（１－１４２０）～１５４４位所示的核苷酸序列且具有指导目 的基因转录或表达功能的核苷酸序列；　（３）在严格条件下能够与（１）或（２）限定的核苷酸序列杂交且具有指导目的基因转录或表达功能的核苷酸序列；　（４）与（１）或（２）限定的核苷酸序列有７０％以上相同性且具有指导目的基因转录或表达功 能的核苷酸序列；或　（５）与（１）－（４）任一限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1. 一种分离的核酸，其特征在于，所述的核酸序列选自下组(1)由SEQ ID NO1中(1-1420)～1544位所示的核苷酸序列构成；(2)具有SEQ ID NO1中(1-1420)～1544位所示的核苷酸序列且具有指导目的基因转录或表达功能的核苷酸序列；(3)在严格条件下能够与(1)或(2)限定的核苷酸序列杂交且具有指导目的基因转录或表达功能的核苷酸序列；(4)与(1)或(2)限定的核苷酸序列有70％以上相同性且具有指导目的基因转录或表达功能的核苷酸序列；或(5)与(1)-(4)任一限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列。2. 如权利要求l所述的核酸，其特征在于，所述的核酸序列选自下组-具有SEQIDNO1中1420--1544位序列具有SEQIDNO1中1361--1544位序列具有SEQIDNO1中1307--1544位序列具有SEQIDNO1中1119--1544位序列具有SEQIDNO1中917 1544位序列；具有SEQIDNO1中665 1544位序歹lJ;具有SEQIDNO1中444 1544位序列；具有SEQIDNO1中1 1544位序列。3. —种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求1或2所述的核酸， 作为启动子元件。4. 一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞 含有权利要求3所述的载体；或其基因组中整合有外源的权利要求1或2所述的核酸。5. —种检测待测核酸中细胞凋亡诱导DEF45样因子A基因启动子甲基化 模式的方法，其特征在于，所述方法包括(1) 应用...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵慕钧，李栋，答亮，李载平，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]