一种分支杆菌差异表达系统及其制备方法与应用技术方案

本发明专利技术属微生物和生物工程领域。涉及一种分支杆菌差异表达系统及其制备方法。本发明专利技术采用结核杆菌ｆｕｒＡ基因启动子／操纵子序列（ｐｆｕｒＡ）及其突变体为启动子构建分支杆菌差异表达的载体系统－－ｐＭＦＡ系列，利用ＢＣＧ为宿主菌差异表达结核杆菌主要保护性抗原。试验结果表明，用ｐＭＦＡ系列，嵌合蛋白Ａｇ８５６Ａ２在耻垢分支杆菌及ＢＣＧ中能在不同ｐｆｕｒＡ启动子系列驱动下差异表达，具有起始密码子及ＡＴ富集区联合突变的ｐｆｕｒＡｍａ导致最高水平的基因表达。本发明专利技术－－ｐＭＦＡ系列，能使任何有价值的免疫优势抗原基因在ＢＣＧ中以不同水平进行差异表达，进一步诱导机体产生最佳的免疫反应，并通过动物实验筛选理想的候选重组ＢＣＧ疫苗。

Differential expression system of mycobacteria and preparation method and application thereof

The invention belongs to the field of microorganism and biological engineering. The invention relates to a differential expression system of mycobacteria and a preparation method thereof. The invention adopts the Mycobacterium tuberculosis furA gene promoter / operon sequence (pfurA) and its mutant construction of expression system of mycobacteria differential - pMFA series as the promoter, expression of Mycobacterium tuberculosis protective antigens to host bacteria by using the difference of BCG. The test results show that, with the pMFA series, the Ag856A2 chimeric protein in Mycobacterium smegmatis and BCG in different pfurA promoter expression difference driven sub series, with the start codon and AT enrichment zone combined mutation of pfurAma leads to the highest level of gene expression. The invention PMFA series, can make any valuable immunodominant antigen gene in BCG with different levels of expression, and further induce optimal immune response, and through animal experiments screening ideal candidate recombinant BCG vaccine.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属微生物和生物工程领域。具体涉及一种分支杆菌差异表达系统及其 制备方法与应用。
技术介绍
结核病是全世界关注的一种主要的公众传染性疾病。早在1993年，世界卫 生组织(WHO)就全球的结核病例日趋增多而宣布结核病疫情进入紧急状态。 目前，全世界约有l/3人口 U8.6亿)携带有结核杆菌，每年约有800万新增病 例，200万人死于结核病；我国大约有活动性结核病人600万，每年有25万人 死于结核病。根据卫生部公布的2005年传染病疫情，在27种法定甲、乙类传染 病中，肺结核的发病数已经超过乙型肝炎，肺结核的死亡数超过了狂犬病，发病 数和死亡数均居第一位。而且，结核病的控制也因为多重抗药性 (Multidrug-resistant, MDR)菌株和艾滋病的出现使得本就越来越严重的结核病 疫情变得更加复杂化。目前，预防结核病唯一有效的疫苗是卡介苗(BaciUus Calmette-Guerin ,BCG)， 一种活的减毒牛型分支杆菌(Mycobacteriumbovis)。然而遗憾的是由于BCG专利技术 的当时还没有冻干技术，用来生产BCG的菌种在早期是通过培养的方法进行传 代和保存的，这种方法一直沿用到20世纪60年代，结果造成了世界各国使用的 卡介苗菌种之间极大的差异性。据统计，在世界各国进行过大小数十次的卡介苗 临床试验，然而试验结果显示，卡介苗对肺结核的免疫保护力为0-80%，差异性 极大(Brewer, T.R and Colditz, G.A. Clin Infect Dis. 1995; 20:126-35. Colditz, G.A., Brewer, T.F.， et al. JAMA. 1994;271:698-702.)。因此，研究一种保护效力超 过BCG的结核病新疫苗势在必行。尽管BCG对成人结核病的保护效力差强人意，但是由丁-其良好的免疫刺激效果以及数十年來业己证实的安全性，使得:n;可作为预防结核病以及其他传染病 的优良细歯表达载体。—报逍证实r不同来源的保护性候选抗原均可在其中克隆并得以表达，从rfU—构建了相应更为卨效的重组BCG疫苗(Stover, C.K., de la Cruz,V.F.， et al. Nature. 1991; 351:456-60. Stover, C.K., Bansal， G.P., et al. .T Exp Med. 1993; 178:197-209. Grode， L., Seiler, P.， et al. J Clin Invest, 2005; 115:2472-9.)。几项 致力于提高针对结核病、麻风病、利氏曼原虫感染的接种效率的研究表明，不同 的抗原可能需要不同的表达水平才能诱导出机体最佳的免疫效果(Bloom, B.R. and Fine, P.E.M. in Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control (Bloom, B.R., Ed.), 1994; pp.531-7. ASM Press. Washington, DC. DasGupta, S.K., Jain, S., et al. Biochem Biophys Res Comimm. 1998; 246:797-804.)。在过去的二十年中，分支杆菌的分子遗传学研究取得了重要的进展。有关研 究利用来源于M./or加Yww质粒pAL5000的复制起点(Ranes, M.G., Rauzier, J., et al. J万ctov'o/， 19卯；172:2793-7.)，构建了多种不同的大肠杆菌-分支杆菌穿梭载体 用来控制分支杆菌的遗传操作及基因表达(Stover, C.K., de la Cmz， V.F., et al. Nature. 1991; 351:456-60. Timm, J.， Lim, E.M. et al. J Bacteriol. 1994;76: 6749-53. Garbe， T.R., Barathi, J., et al. Microbiology, ]994; 140: 133-8.)。研究发现 大部分分支杆菌的表达载体都依赖于热休克蛋白fe; 60基因的启动子(pfcp仰)， 因而这在一定程度上限制了基因表达的范围(Stover， C.K., de la Cruz, V.F., et al. Nature. 1991; 351:456-60. Stover, C.K., Bansal, G.P., et al. J Exp Med. 1993);而且 pfe; 60来源质粒的稳定性也受到了一定的质疑(Kumar, D., Srivastava, B.S. et al. Vaccine, 1998; 16: 1212-5. Haeseleer, F. Res Microbiol, 1994; 145: 683-7.)， Al-Zarouni和Dak最近报道了 pfo/ 60在电转化后的短暂诱导过程中易导致其质 粒的不稳定(Al陽Zarouni, M. and Dale, J.W. rw6e rw/asz;s 2002; 82:283-91.)。其他早期成功应用的启动子，包括那些分别来源于M famsaW a抗原 (Matsuo， K., Yamaguchi, R et al. iw薩，1990; 58: 4049-54.)、 M戸加由腳/a^ IS900 ORF2(Murray， A., Winter, N., et al. Mo/ Mc油'o/, 1992; 6: 3331-42.)、 M A 19 kDa抗原(Stover, C.K., Bansal, G.P., et al. J Exp Med. 1993)、 M /eprae 18 kDa抗原(Dellagostin, O.A., Esposito, G., et al. Mz'cro6Zo/ogy, 1995; 141: 1785-92.)等基因的启动子。然而，由于对分支杆菌转录调节机制缺乏足够的认识， 阻碍了其调控基因表达的多功能表达载体的建立。p/wM尽管被证实为强启动子(Sala, C., Forti， F., et al. J5am'o/, 2003; 185: 5357-62. Zahrt, T.C.， Song, J.， et al. MoZ M'm^'o/, 2001; 39:1174-85.)，然而，在正常的生长条件下，p/M活性几乎被其自身编码的FurA蛋白所阻遏。如果保守 的/wM基因上游调控区的23-bp AT富集区序列突变(p/w^m)，则可以阻止FurA 蛋白与其结合并解除阻遏；而且，该种形式的突变也不会降低p/w^活性，因为 当其克隆至/uxJ5报告基因上游时可表现比野生型启动子高得多的荧光素酶活 性。而起始密码子GTG突变为ATG，翻译起始效率可以提高2-4倍(Shaw, G.C. and Fulco, A丄J5zo/ C/ e附，1992; 267: 5515-26. Martin, R.G. and Rosner， J丄.Mo/ Mc油W, 2004; 5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分支杆菌差异表达系统，其特征是以结核杆菌ｆｕｒＡ基因调控序列及其突变体为启动子，实现外源基因在分支杆菌中差异表达；通过下述方法制备：　用突变引物对结核分支杆菌ｆｕｒＡ基因操纵子序列ＰＣＲ扩增，分别产生启动子ｐｆｕｒＡ、启动子ｐｆｕ ｒＡｍ，启动子ｐｆｕｒＡａ，启动子ｐｆｕｒＡｍａ后，所述的ｐｆｕｒＡ系列克隆至启动子探针载体ｐＭＣ２１０，并亚克隆至父系穿梭载体ｐＭＶ２６１中，取代其ＢＣＧ　ｐｈｓｐ６０启动子及部分酶切位点，建立分支杆菌差异表达载体，命名为ｐＭＦＡ系列。

【技术特征摘要】
1、一种分支杆菌差异表达系统，其特征是以结核杆菌furA基因调控序列及其突变体为启动子，实现外源基因在分支杆菌中差异表达；通过下述方法制备用突变引物对结核分支杆菌furA基因操纵子序列PCR扩增，分别产生启动子pfurA、启动子pfurAm，启动子pfurAa，启动子pfurAma后，所述的pfurA系列克隆至启动子探针载体pMC210，并亚克隆至父系穿梭载体pMV261中，取代其BCG phsp60启动子及部分酶切位点，建立分支杆菌差异表达载体，命名为pMFA系列。2、 按权利要求1所述的分支杆菌差异表达系统，其特征是所述的启动子 pfiirAm是AT富集区序列6-bp替换突变的启动子，所述的启动子pfiarAa是起始 密码GTG突变为ATG的启动子，所述的启动子pforAma为兼有启动子pforAm 和pfiirAa突变的启动子。3、 权利要求1所述的分支杆菌差异表达系统的制备方法，其特征是包括下 述步骤1) 构建分支杆菌-大肠杆菌穿梭探针载体pMC210:以pSV-P-gal质粒为模板，/acZ-F和/acZ-R为引物，PCR扩增获得截短的 大肠杆菌/cZ基因片段9-1023 aa.，经Sa!M-战m/111双酶切消化后克隆至 pBluescript KS得pKS-LacZ，，质粒pMV261经.Yk,I-顶tmi双酶切消化去除BCG fo/7(50启...

【专利技术属性】
技术研发人员：范小勇，赵国屏，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]