【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及发酵，尤其是指一种茶氨酸生产菌株及其在茶发酵生产中的应用。
技术介绍
1、茶氨酸，是茶叶中含量最丰富的天然非蛋白质氨基酸。研究表明，茶氨酸是茶叶鲜爽味的主要来源，可以与谷氨酸和脯氨酸等协同作用，从而减弱茶汤的苦涩味，增加茶汤的鲜爽味；茶氨酸同时还具备防治神经损伤，抑制癌细胞侵袭、迁移，抗抑郁等多种生理功能，在食品和医药领域应用广泛。在茶叶中，茶氨酸主要由茶发酵过程产生。在茶发酵过程中，微生物菌群利用谷氨酸、乙胺等前体物质合成茶氨酸，占茶叶游离氨基酸总量的50％以上。
2、茶氨酸工业化生产方法主要有植物分离提取法、植物组织细胞培养法、化学合成法和微生物法。植物分离提取法和植物组织细胞培养法由于生产茶氨酸成本高，规模受到限制，且分离过程中使用大量的化学试剂，易造成环境污染，无法大规模推广应用；化学合成法得到的d、l-型茶氨酸需要进一步拆分，分离成本较高，产品收率较低，且反应副产物多；微生物法由于不受原料限制，价格低廉，催化效率高，立体专一性强等优点已成为工业化茶氨酸生产的主流方式，具有巨大的发展潜力。
3、cn104404075a专利报道了一种利用重组bacillus subtilis分泌γ-谷氨酰转肽酶来催化l-谷氨酰胺和乙胺生成l-茶氨酸的方法，通过扩增枯草芽孢杆菌中γ-谷氨酰转肽酶(ggt)的基因，并克隆到枯草芽孢杆菌168中进行过量表达，以80mm l-谷氨酰胺为供体，640mm乙胺作为受体，l-茶氨酸转化率达到86％以上。cn109777763b专利报道了一种以葡萄糖等廉价碳源为底物从
4、研究表明，茶氨酸合成需要谷氨酸以及乙胺为前体物质，其中乙胺的合成是茶氨酸生成的限速步骤。在茶树细胞内，乙胺主要由丙氨酸脱羧酶催化丙酮酸转化生成，但由于植物来源的丙氨酸脱羧酶在细菌中表达量较低，因此茶氨酸的产量常受到限制。并且在体外流加乙胺生成茶氨酸过程中，乙胺气化后容易对人体健康不利。因此，减少乙胺的使用，构建以葡萄糖从头合成茶氨酸基因工程菌株并通过基因工程手段提高茶氨酸的产量是目前亟需解决的技术难题。
技术实现思路
1、为解决以上指出的技术问题。本专利技术提供了一种茶氨酸生产菌株及其在茶发酵生产中的应用。本专利技术对茶氨酸合成关键限速酶丙酮酸脱羧酶进行改造并构建了一株茶氨酸高产菌株，在不添加外源前体的条件下利用葡萄糖从头合成茶氨酸，提高茶氨酸的产量。
2、本专利技术的第一个目的在于提供一种丙氨酸脱羧酶csaladc突变体，所述丙氨酸脱羧酶csaladc突变体是以序列为seq id no.1所示的原始丙氨酸脱羧酶基础上，由第177位异亮氨酸突变为酪氨酸，所述丙氨酸脱羧酶csaladc突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示。
3、本专利技术的第二个目的在于提供编码所述丙氨酸脱羧酶csaladc突变体的基因。
4、本专利技术的第三个目的在于提供一种包含所述的基因的重组载体。
5、本专利技术的第四个目的在于提供一种包含所述基因的谷氨酸棒杆菌。
6、本专利技术的第五个目的在于提供一种茶氨酸生产菌株，所述茶氨酸生产菌株以所述谷氨酸棒杆菌为出发菌株，依次敲除α-酮戊二酸脱氢酶e1亚基基因odha、谷氨酸外转运蛋白基因ncg11221以及乳酸脱氢酶基因ldh；并过表达柠檬酸合酶基因glta、丙酮酸激酶基因pyk、谷氨酸脱氢酶基因gdh。
7、在本专利技术的一个实施例中，所述α-酮戊二酸脱氢酶e1亚基基因odha的序列如seqid no.3所示；所述谷氨酸外转运蛋白基因ncg11221的序列如seq id no.4所示；所述乳酸脱氢酶基因ldh的序列如seq id no.5所示。
8、在本专利技术的一个实施例中，所述柠檬酸合酶基因glta的序列如seq id no.6所示；
9、所述丙酮酸激酶基因pyk的序列如seq id no.7所示；
10、谷氨酸脱氢酶基因gdh的序列如seq id no.8所示；
11、所述茶氨酸生产菌株的表达载体为质粒pec-xk99或pxmj19。
12、在本专利技术的一个实施例中，还包括过表达丙氨酸脱氢酶alaa，并将γ-谷氨基甲酰胺合成酶gmas整合至谷氨酸棒杆菌的cg1960假基因位点。
13、在本专利技术的一个实施例中，所述丙氨酸脱氢酶alaa的序列如seq id no.9所示；
14、所述γ-谷氨基甲酰胺合成酶gmas的序列如seq id no.10所示；
15、所述cg1960假基因位点的序列如seq id no.11所示
16、所述茶氨酸生产菌株的表达载体为质粒pxmj19或pec-xk99。
17、在本专利技术的具体实施例中，所述茶氨酸生产菌株的构建方法，包括以下步骤：
18、以包含丙氨酸脱羧酶csaladc突变体的谷氨酸棒杆菌为出发菌株，依次敲除α-酮戊二酸脱氢酶e1亚基基因odha、谷氨酸外转运蛋白基因ncg11221以及乳酸脱氢酶基因ldh；和/或，表达了柠檬酸合酶基因glta、丙酮酸激酶基因pyk、谷氨酸脱氢酶基因gdh；和/或，过表达丙氨酸脱氢酶alaa，并将γ-谷氨基甲酰胺合成酶gmas整合至谷氨酸棒杆菌的cg1960假基因位点，构建得到所述茶氨酸生产菌株。
19、本专利技术的第六个目的在于提供所述谷氨酸棒杆菌、所述茶氨酸生产菌株在发酵产茶氨酸中的应用。
20、本专利技术的第七个目的在于提供所述谷氨酸棒杆菌、所述茶氨酸生产菌株在茶发酵过程中的应用。
21、在本专利技术的一个实施例中，所述茶发酵过程的步骤如下：
22、s1、将所述谷氨酸棒杆菌或所述茶氨酸生产菌株接种至种子培养基中，振荡培养，得到种子液，离心重悬得到重悬菌体；
23、s2、将红茶研磨至粉末状，并加入纯净水，加热煮，固液分离并收集滤液，对所得滤液进行过滤除菌，得到红茶提取液；
24、s3、将s1中所得重悬菌体经沉淀后得到的固相加入到s2所得红茶提取液中，并加入葡萄糖和半乳糖，进行发酵，取发酵液的上清液，过滤除菌，得到红本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种丙氨酸脱羧酶CsAlaDC突变体，其特征在于，所述丙氨酸脱羧酶CsAlaDC突变体是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的原始丙氨酸脱羧酶基础上，由第177位异亮氨酸突变为酪氨酸，所述丙氨酸脱羧酶CsAlaDC突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.编码如权利要求1所述丙氨酸脱羧酶CsAlaDC突变体的基因。
3.一种包含权利要求2所述基因的重组载体。
4.一种包含权利要求1中所述的丙氨酸脱羧酶CsAlaDC突变体、权利要求2所述的基因或权利要求3所述的基因的重组载体的谷氨酸棒杆菌。
5.一种茶氨酸生产菌株，其特征在于，所述茶氨酸生产菌株以权利要求4中所述谷氨酸棒杆菌为出发菌株，依次敲除α-酮戊二酸脱氢酶E1亚基基因odhA、谷氨酸外转运蛋白基因Ncg11221以及乳酸脱氢酶基因ldh；并过表达柠檬酸合酶基因gltA、丙酮酸激酶基因pyk、谷氨酸脱氢酶基因gdh。
6.根据权利要求5所述的茶氨酸生产菌株，其特征在于，还包括过表达丙氨酸脱氢酶alaA，并将γ-谷氨基甲酰胺合成酶GMAS整合至谷氨酸
7.根据权利要求6所述的茶氨酸生产菌株，其特征在于，所述丙氨酸脱氢酶alaA的序列如SEQ ID NO.9所示；所述γ-谷氨基甲酰胺合成酶GMAS的序列如SEQ ID NO.10所示；所述茶氨酸生产菌株的表达载体为质粒pXMJ19或pEC-XK99E。
8.权利要求4所述的谷氨酸棒杆菌、权利要求5-7中任一项所述茶氨酸生产菌株在发酵产茶氨酸中的应用。
9.权利要求4所述的谷氨酸棒杆菌、权利要求5-7中任一项所述茶氨酸生产菌株在茶发酵过程中的应用。
10.根据权利要求9中所述的应用，其特征在于，所述茶发酵过程的步骤如下：
...【技术特征摘要】
1.一种丙氨酸脱羧酶csaladc突变体，其特征在于，所述丙氨酸脱羧酶csaladc突变体是以氨基酸序列如seq id no.1所示的原始丙氨酸脱羧酶基础上，由第177位异亮氨酸突变为酪氨酸，所述丙氨酸脱羧酶csaladc突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示。
2.编码如权利要求1所述丙氨酸脱羧酶csaladc突变体的基因。
3.一种包含权利要求2所述基因的重组载体。
4.一种包含权利要求1中所述的丙氨酸脱羧酶csaladc突变体、权利要求2所述的基因或权利要求3所述的基因的重组载体的谷氨酸棒杆菌。
5.一种茶氨酸生产菌株，其特征在于，所述茶氨酸生产菌株以权利要求4中所述谷氨酸棒杆菌为出发菌株，依次敲除α-酮戊二酸脱氢酶e1亚基基因odha、谷氨酸外转运蛋白基因ncg11221以及乳酸脱氢酶基因ldh；并过表达柠檬酸合酶基因glta...
【专利技术属性】
技术研发人员：彭卫华，黄泽婷，禤捷，季顺哲，左朦，
申请(专利权)人：广州中妆美业化妆品有限公司，
类型：发明
国别省市：
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