【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于蛋白质聚集体分离纯化的方法。本方法聚集体靶向荧光分子标记细胞中的蛋白质聚集体，并在细胞裂解后使用蔗糖密度梯度离心的方式分离纯化蛋白质聚集体。
技术介绍
1、蛋白质聚集体是细胞在环境压力、衰老和突变等情况下蛋白质稳态失衡后产生的由错误折叠蛋白聚集形成的复合体。一般说来，蛋白质聚集体被认为是多种神经退行性疾病的致病因素，例如阿尔兹海默症、渐冻症和帕金森综合征等。目前，对蛋白质聚集体的研究主要通过靶向荧光分子在细胞中原位标记的方式，对其的分离纯化技术仍然十分缺乏。对蛋白质聚集体的分离纯化是确定其组成与结构的前提，将对细胞的蛋白质稳态调节机制的研究，以及阐述神经退行性疾病的发病机理至关重要。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术涉及一种用于蛋白质聚集体分离纯化的方法，本专利技术的目的为提供了一种从组织和细胞中分离纯化出蛋白质聚集体的方法。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、一种用于蛋白质聚集体分离纯化的方法，包括以下步骤：
4、首先将组织和细胞使用聚集体靶向荧光分子染色12-24小时，组织和细胞经预处理，分散在含有10％甘油的磷酸盐缓冲液(gpbs)中，通过27g针头反复挤压形成细胞裂解液。然后将蔗糖溶于含有gpbs缓冲液中，配制成不同质量浓度的蔗糖溶液，然后采用层铺法配制30％～80％的蔗糖密度梯度离心液。将细胞裂解液注入蔗糖密度梯度离心液的最上层。在4℃下，以20,000-50,000g，离心1
5、进一步的，所述聚集体靶向荧光分子包括但不限于aggresome dye(enz-51039，艾美捷)、硫代黄素t(tht，kfs139，百奥莱博)。
6、进一步的，组织或细胞样品的预处理过程为，若为组织样品，将组织切成厚度为0.1-0.3mm的小块放入离心管中,加入缓冲液，组织匀浆仪转速35,000-50,000rpm，匀浆20-40秒；
7、若为细胞样品，每1×107细胞中加入1-1.2ml胰蛋白酶消化后分散在缓冲液中；
8、所述缓冲液为含体积分数1％蛋白酶抑制剂(cocktail)和体积分数10％甘油的磷酸盐缓冲液，ph 7.5。
9、进一步的，将蔗糖溶于gpbs缓冲液中，配制成质量浓度为30％-80％的蔗糖溶液，采用层铺法从下往上按照浓度由高到低将蔗糖溶液逐层注入离心管中，每层均为0.2–2ml。
10、进一步的，离心管中细胞裂解液的注入量为0.5-1.5ml，20,000-50,000g离心1-2h，按每个级分300-500μl使用移液枪从上往下逐级吸取离心管中溶液进行分级。
11、进一步的，根据荧光分子确定激发波长和发射波长，荧光分子aggresome dye，采用荧光分光光度计的激发波长为540nm，测定每一级分在580nm处的荧光发射强度；荧光分子tht，采用荧光分光光度计的激发波长为440nm，测定每一级分在520nm处的荧光发射强度，强烈荧光发射的级分即为含有蛋白质聚集体的级分。
12、进一步地，向获得的蛋白质聚集体所在级分中，逐滴加入到5-20ml丙酮溶液，2,000–16,000g离心得蛋白质沉淀，该沉淀即为蛋白质聚集体
13、本专利技术适用于分离纯化组织和细胞中的蛋白质聚集体，重复性好，回收率高，分离纯度高，操作简便。
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1.一种用于蛋白质聚集体分离纯化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中聚集体靶向荧光分子包括但不限于aggresome dye(ENZ-51039，艾美捷)、硫代黄素T(THT，KFS139，百奥莱博)。
3.据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中组织或细胞样品的预处理为，若为组织样品，其预处理为：将组织切成厚度为0.1-0.3mm的小块放入离心管中,加入缓冲液，组织匀浆仪转速35,000-50,000rpm，匀浆20-40秒；若为细胞样品，细胞中加入胰蛋白酶消化并分散在缓冲液中；所述缓冲液为含体积分数1％蛋白酶抑制剂(cocktail)和体积分数10％甘油的磷酸盐缓冲液，pH 7.5。
4.据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中细胞裂解的方式为，使用尺寸规格为27G的针头反复反复挤压10–20次，将细胞挤破从而形成细胞裂解液。
5.据权利要求1所述的方法，其特征在于，将蔗糖溶于GPBS缓冲液中，配制成质量浓度为30％-80％的蔗糖溶液，采用层铺法从下往上按照浓
6.据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中细胞裂解液的注入量为0.5-1.5ml，20,000-50,000g离心1-2h，按每个级分300-500μL使用移液枪从上往下逐级吸取离心管中溶液进行分级。
7.据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)根据荧光分子确定激发波长和发射波长，荧光分子aggresome dye，采用荧光分光光度计的激发波长为540nm，测定每一级分在580nm处的荧光发射强度；荧光分子THT，采用荧光分光光度计的激发波长为440nm，测定每一级分在520nm处的荧光发射强度，强烈荧光发射的级分即为含有蛋白质聚集体的级分。
8.据权利要求1所述的方法，其特征在于，向步骤5)获得的蛋白质聚集体所在级分中，逐滴加入到5-20mL丙酮溶液，2,000–16,000g离心得蛋白质沉淀，该沉淀即为蛋白质聚集体。
...【技术特征摘要】
1.一种用于蛋白质聚集体分离纯化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中聚集体靶向荧光分子包括但不限于aggresome dye(enz-51039，艾美捷)、硫代黄素t(tht，kfs139，百奥莱博)。
3.据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中组织或细胞样品的预处理为，若为组织样品，其预处理为：将组织切成厚度为0.1-0.3mm的小块放入离心管中,加入缓冲液，组织匀浆仪转速35,000-50,000rpm，匀浆20-40秒；若为细胞样品，细胞中加入胰蛋白酶消化并分散在缓冲液中；所述缓冲液为含体积分数1％蛋白酶抑制剂(cocktail)和体积分数10％甘油的磷酸盐缓冲液，ph 7.5。
4.据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中细胞裂解的方式为，使用尺寸规格为27g的针头反复反复挤压10–20次，将细胞挤破从而形成细胞裂解液。
5.据权利要求1所述的方法，其特征在于，将蔗糖溶于gpbs缓...
【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，陈宇文，赵群，杨开广，赵楠，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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