【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，更具体地，本专利技术涉及新型的对映-贝壳杉烯羟化酶或其变体，特异催化对映-贝壳杉烯及其衍生物15位，7位或14的羟基化。
技术介绍
1、冬凌草(isodon rubescens)又名冰凌草、冰凌花等，为唇形科香菜属碎米桠变种，多年生草本植物。全草入药，具有良好的清热解毒、活血止痛、抑菌、抗肿瘤作用，极具综合开发利用价值。冬凌草的化学成分主要为二萜化合物，另外也报道含有三萜、黄酮和生物碱类化合物。上个世纪70年代，从该植物中分离得到一个对映-贝壳杉烯型二萜类(ent-kaurene diterpenoid)化合物冬凌草甲素(oridonin)，该化合物具有非常显著的抗肿瘤活性，对多种移植性肿瘤有效，临床上主要用于白血病、食道癌、肝癌等治疗，因此受到广泛关注。冬凌草甲素还分布于其他唇形科香茶菜属植物，例如香茶菜(i.amethystoides)、显脉叶香茶菜(i.neruosa)、毛叶香茶菜(i.rabdosia)，道罕香茶菜(i.downsis)和延命草(i.japonicus)等中。目前为止，对于冬凌草甲素的研究已经涉及植物化学、药理作用，提取工艺和结构修饰等诸多方面，然而对于其完整的生物合成途径却知之甚少。
2、冬凌草甲素和其他贝壳杉烯型二萜类化合物(赤霉素、甜菊糖苷等)均具有相同的生物合成前体对映-贝壳杉烯(ent-kaurene)。目前推测冬凌草甲素由前体对映-贝壳杉烯经过若干步p450酶氧化反应之后分子内环化形成。冬凌草甲素生物合成所涉及的多种p450氧化修饰酶目前为止没有任何一个得到鉴定
3、通过生物合成的方法有望替代传统植提方法，然而其前提条件是生物合成酶基因的解析及合成途径的确定，这是本领域亟待开发研究的。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供新型对映-贝壳杉烯羟化酶及其应用。
2、在本专利技术的第一方面，提供一种使对映-贝壳杉烯(ent-kaurene)发生羟基化的方法，包括：以对映-贝壳杉烯羟化酶催化所述对映-贝壳杉烯，使其第15、7或14位羟基化；其中，羟基化产物为15β-羟基对映-贝壳杉烯(kau-15β-ol)，所述对映-贝壳杉烯羟化酶选自cyp706v7、cyp706v4、cyp706v9、cyp706v15或cyp706v16或其保守性变异蛋白；或，羟基化产物为7β-羟基对映-贝壳杉烯(kau-7β-ol)，所述对映-贝壳杉烯羟化酶选自cyp706v2、cyp706v3或cyp706v8或其保守性变异蛋白；或，羟基化产物为14β-羟基对映-贝壳杉烯(kau-14β-ol)，所述对映-贝壳杉烯羟化酶为cyp706v6或其保守性变异蛋白；或，羟基化产物为7β,15β-二羟基对映-贝壳杉烯(kau-7β,15β-diol)，所述对映-贝壳杉烯羟化酶为cyp706v7与cyp706v2的组合或它们的保守性变异蛋白。
3、在一种或多种优选实施方式中，所述对映-贝壳杉烯羟化酶为(a)seq id no:8所示的cyp706v7，seq id no:7所示的cyp706v4，seq id no:9所示的cyp706v9，seq id no:10所示的cyp706v15，seq id no:11所示的cyp706v16，seq id no:1所示的cyp706v2，seq idno:2所示的cyp706v3，seq id no:3所示的cyp706v8，seq id no:17所示的cyp706v6；或为(a)的酶的保守性变异蛋白；
4、在一种或多种优选实施方式中，所述(a)的酶的保守性变异蛋白包括选自：
5、(b)将(a)中的酶的序列经过一个或多个(如1-30或1-20个；较佳地1-10个；较佳地1-5个、1-3个或1-2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有使对映-贝壳杉烯发生羟基化功能的衍生的蛋白；
6、(c)氨基酸序列与(a)中的酶的序列有80％以上(较佳地85％以上、90％以上或95％以上；如98％以上或99％以上)相同性且具有使对映-贝壳杉烯发生羟基化功能的衍生的蛋白；或
7、(d)在(a)中的酶的n或c末端添加标签序列，或在其n末端添加信号肽序列后形成的蛋白。
8、在一种或多种优选实施方式中，所述(a)的酶的保守性变异蛋白是截短变体；较佳地为截去n端跨膜区域的截短变体；更佳地，所述截短变体具有：seq id no:8截去第1-20位后的序列，seq id no:7截去第1-27位后的序列，seq id no:9截去第1-20位后的序列，seqid no:10截去第1-27位，seq id no:11截去第1-27位后的序列后的序列，seq id no:1截去第1-27位后的序列，seq id no:2截去第1-27位后的序列，seq id no:3截去第1-25位后的序列，和/或seq id no:17截去第1-24位后的序列。
9、在一种或多种优选实施方式中，所述(a)的酶的保守性变异蛋白是在对映-贝壳杉烯羟化酶或其截短变体的n端融合有标签的变体，所述标签能增加蛋白可溶性或稳定性；较佳地，所述标签是17α；较佳地，所述标签的氨基酸序列如seq id no:19所示。
10、在一种或多种优选实施方式中，所述方法在体外进行(如通过化学反应对底物进行催化)或在细胞内进行(如通过基因工程细胞进行生物合成)；较佳地，所述方法在细胞内进行；较佳地，所述细胞是原核细胞或真核细胞；较佳地，所述原核细胞包括大肠杆菌或枯草杆菌，优选大肠杆菌；较佳地，所述真核细胞包括真菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；较佳地，所述真菌细胞为酵母细胞(如毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母或假丝酵母)。
11、在一种或多种优选实施方式中，所述方法在细胞(宿主细胞)内进行，所述细胞内包括(天然存在或异源引入)：模块i(前体合成)：包括甲羟戊酸通路(mva)和甲基赤藓醇磷酸通路(mep)，产生ipp与dmapp；模块ii(二萜母核合成)：以ipp与dmapp为底物，产生对映-贝壳杉烯。
12、在一种或多种优选实施方式中，所述细胞还表达选自以下的一种或多种或全部蛋白：ggpps、ent-cps、ks、cpr，或含有编码所述蛋白的核酸构建物。
13、在一种或多种优选实施方式中，所述细胞还表达甲羟戊酸通路途径的蛋白或含有编码所述蛋白的核酸构建物。
14、在一种或多种优选实施方式中，所述甲羟戊酸通路的蛋白包括选自以下的一种或多种：mvd、pmk、mvk、hmgr、hm本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种使对映-贝壳杉烯发生羟基化的方法，包括：以对映-贝壳杉烯羟化酶催化所述对映-贝壳杉烯，使其第7、15或14位羟基化；其中，
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对映-贝壳杉烯羟化酶为(a)SEQ IDNO:8所示的CYP706V7，SEQ ID NO:7所示的CYP706V4，SEQ ID NO:9所示的CYP706V9，SEQ ID NO:10所示的CYP706V15，SEQ ID NO:11所示的CYP706V16，SEQ ID NO:1所示的CYP706V2，SEQID NO:2所示的CYP706V3，SEQ ID NO:3所示的CYP706V8，SEQ ID NO:17所示的CYP706V6；或为(a)的酶的保守性变异蛋白。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述(a)的酶的保守性变异蛋白包括选自：
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述(a)的酶的保守性变异蛋白是截短变体；较佳地为截去N端跨膜区域的截短变体；更佳地，所述截短变体具有：SEQ IDNO:8截去第1-20位后的序列，SEQ ID NO:7截
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法在体外进行或在细胞内进行；较佳地，所述方法在细胞内进行；较佳地，所述细胞是原核细胞或真核细胞；较佳地，所述原核细胞包括大肠杆菌或枯草杆菌，优选大肠杆菌；较佳地，所述真核细胞包括真菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；较佳地，所述真菌细胞为酵母细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法在细胞内进行，所述细胞内包括：
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述细胞在TB培养基中培养；或
8.对映-贝壳杉烯羟化酶的应用，用于使对映-贝壳杉烯发生羟基化；其中，
9.用于使对映-贝壳杉烯发生羟基化的对映-贝壳杉烯羟化酶，所述酶选自：CYP706V7，CYP706V4，CYP706V9，CYP706V15，CYP706V16，CYP706V2，CYP706V3，CYP706V8，CYP706V6或其保守性变异蛋白；
10.如权利要求9所述的使对映-贝壳杉烯发生羟基化的对映-贝壳杉烯羟化酶，其特征在于，所述(a)的酶的保守性变异蛋白包括选自：
11.如权利要求9或10所述的使对映-贝壳杉烯发生羟基化的对映-贝壳杉烯羟化酶，其特征在于，所述(a)的酶的保守性变异蛋白是截短变体；较佳地为截去N端跨膜区域的截短变体；更佳地，所述截短变体具有：SEQ ID NO:7截去第1-27位后的序列，SEQ IDNO:8截去第1-20位后的序列，SEQ ID NO:9截去第1-20位后的序列，SEQ ID NO:10截去第1-27位，SEQID NO:11截去第1-27位后的序列后的序列，SEQ ID NO:1截去第1-27位后的序列，SEQ IDNO:2截去第1-27位后的序列，SEQ ID NO:3截去第1-25位后的序列，和/或SEQ ID NO:17截去第1-24位后的序列；或
12.一种核酸分子，其编码权利要求9-11任一所述的用于使对映-贝壳杉烯发生羟基化的对映-贝壳杉烯羟化酶；较佳地，所述核酸分子经密码子优化。
13.如权利要求12所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸具有选自以下的一项或多项所述的序列：
14.一种核酸构建物，含有权利要求12或13所述的核酸分子；较佳地，所述核酸构建物是载体，例如克隆载体、整合载体或表达载体。
15.一种宿主细胞，所述宿主细胞：
16.如权利要求15所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞还表达选自以下的一种或多种或全部蛋白：GGPPS、ent-CPS、KS、CPR，或含有编码所述蛋白的核酸构建物；和/或，所述宿主细胞还表达甲羟戊酸通路的蛋白或含有编码所述蛋白的核酸构建物；
17.一种用于使对映-贝壳杉烯发生羟基化的试剂盒，其中包括：
...【技术特征摘要】
1.一种使对映-贝壳杉烯发生羟基化的方法，包括：以对映-贝壳杉烯羟化酶催化所述对映-贝壳杉烯，使其第7、15或14位羟基化；其中，
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对映-贝壳杉烯羟化酶为(a)seq idno:8所示的cyp706v7，seq id no:7所示的cyp706v4，seq id no:9所示的cyp706v9，seq id no:10所示的cyp706v15，seq id no:11所示的cyp706v16，seq id no:1所示的cyp706v2，seqid no:2所示的cyp706v3，seq id no:3所示的cyp706v8，seq id no:17所示的cyp706v6；或为(a)的酶的保守性变异蛋白。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述(a)的酶的保守性变异蛋白包括选自：
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述(a)的酶的保守性变异蛋白是截短变体；较佳地为截去n端跨膜区域的截短变体；更佳地，所述截短变体具有：seq idno:8截去第1-20位后的序列，seq id no:7截去第1-27位后的序列，seq id no:9截去第1-20位后的序列，seq id no:10截去第1-27位，seq id no:11截去第1-27位后的序列后的序列，seq idno:1截去第1-27位后的序列，seq id no:2截去第1-27位后的序列，seq id no:3截去第1-25位后的序列，和/或seq id no:17截去第1-24位后的序列；或
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法在体外进行或在细胞内进行；较佳地，所述方法在细胞内进行；较佳地，所述细胞是原核细胞或真核细胞；较佳地，所述原核细胞包括大肠杆菌或枯草杆菌，优选大肠杆菌；较佳地，所述真核细胞包括真菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；较佳地，所述真菌细胞为酵母细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法在细胞内进行，所述细胞内包括：
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述细胞在tb培养基中培养；或
8.对映-贝壳杉烯羟化酶的...
【专利技术属性】
技术研发人员：王勇，孙雨伟，邵洁，刘海利，
申请(专利权)人：中国科学院分子植物科学卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：
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