一种具有降血糖生物活性的苦瓜多肽基因工程制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种具有降血糖生物活性的苦瓜多肽基因工程制备方法及应用。本发明专利技术方法包括表达载体的构建，表达、纯化等。本发明专利技术方法能够定向、稳定、高效的表达出具有生物学活性的功能多肽，有利于工业化生产。经动物实验证明采用本发明专利技术制备的多肽能显著降低糖尿病模型动物的血糖值，可用于制备防治糖尿病的药物。

Gene engineering preparation method and application of Momordica charantia polypeptide with hypoglycemic activity

The present invention provides a bitter gourd polypeptide gene engineering preparation method and application thereof. The method of the invention comprises the construction of an expression vector, expression, purification and the like. The method of the invention can directionally, stably and efficiently express functional polypeptides with biological activity, and is favorable for industrial production. The animal experiment proved that the polypeptide prepared by the invention can obviously reduce the blood sugar value of the diabetic model animal, and can be used for preparing medicine for preventing and treating diabetes.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程，具体涉及一种具有降血糖生物活性苦瓜多肽KGP的 基因工程制备方法及其在制备防治糖尿病药物中的应用。
技术介绍
糖尿病是现代社会对人类威胁最大的疾病之一，患者呈逐年增加的趋势。目 前临床除了静脉注射胰岛素外还主要应用四类口服降血糖药物，它们是磺脲类、 双胍类、葡萄糖苷酶抑制剂和噻唑烷酮类。这些口服化学类降糖药物会引起耐药 性，乳酸中毒和肝损伤等一系列毒副作用，而采用注射胰岛素疗往往给患者造成 很多不便，因此迫切需要一种使用方便、疗效好、副作用小、可长期安全使用的 治疗新药。苦瓜是东南亚国家的一种传统植物药材，经临床实验和动物实验都表明其具 有显著的降血糖活性，并且能够缓和和减轻糖尿病引起的并发症。(Kathy Abascal 等Alternative & Complementary Therapies,(2005)，179-184)同时在摄入正常剂量 的情况下，不会引起任何的肝、肾毒性。(J.K. Grover等Journal of Ethnophamacology,93(2004)123-132) Khanna等在1979年从苦瓜中分离出具有类 胰岛素活性的多肽P具有显著的降糖效果。(Pushpa Khanna等Journal of Natural Products,44(6)， 1979,648-654)其后研究者又从苦瓜中陆续分离出多种物质，包括 甙类、蛋白质类等都具有显著的降血糖效果。由于苦瓜中降血糖活性成分种类多样，作用方式呈多方位多靶点，而其单个活性组分含量较低。因此如何大量提供和生产这些活性组分舉作为药品开发需要 解决的问题。应用现代生物工程技术将具有降血糖生物活性多肽在生物工程菌中 高效表达，实现大规模工业化发酵生产是解决问题的有效途径。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于应用基因工程的方法，克隆目的蛋白基因，在 工程菌中高效表达、纯化和功能鉴定具有降血糖生物活性的苦瓜多肽。本专利技术提供一种发酵生产具有降血糖生物活性苦瓜多肽KGP的方法。该方 法是按照苦瓜中已经公开的降血糖活性多肽的氨基酸序列，根据工程菌偏爱的密 码子特性，人工化学合成相应的核苷酸序列，构建表达载体，转化宿主菌，在适 当条件下诱导表达，表达的蛋白用亲和层析介质纯化，将纯化的目的蛋白透析去 盐，冷冻干燥。本专利技术方法包括下列步骤(1) PCR法合成两端带有限制性酶切位点的有如SEQ ID:1寡核苷酸序列 的具有降血糖生物活性苦瓜多肽KGP核苷酸编码序列，并进一步优化为SEQ ID:2;(2) 将步骤(1)中得到的核苷酸序列连结到表达载体中，得到重组表达载体；(3) 将步骤(2)中得到的重组表达载体转化到大肠杆菌宿主中，并在表达 步骤(1)中所述的核苷酸编码序列的KGP的条件下，培养被转化的宿主细胞；(4) 从步骤(3)培养的宿主细胞的培养基中和细胞内回收并纯化表达产物 具有降血糖生物活性的苦瓜多肽。所述步骤(1)限制性酶切位点N端是BamHI酶切位点，C端是HindIII酶切位 点。采用的生物工程菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、面包酵母或毕赤酵母。步骤(2)表达载体是携带T7/T5启动子的pET/pQE质粒及其衍生物。具体表 达载体是pET32a/pQE8。步骤(3)的大肠杆菌宿主是大肠杆菌BL21 (DE3) / M15细胞系。步骤(4)的回收并纯化采用镍柱亲和纯化。本专利技术的具有降血糖生物活性苦瓜多肽KGP核苷酸编码序列是指从SEQ ID:2核酸序列的第21个碱基至第75个碱基。其中的KGP核苷酸编码序列是从 SEQID:2的第23位，第35位的密码子为A;第29位，第38位的密码子为T; 第68位和第71位的密码子为A和G中的一种。根据本专利技术，首先依据已公开的苦瓜降糖活性多肽序列如SEQ ID:3序列， 根据大肠杆菌偏爱的密码子，提供了人工设计合成带有BamHI酶切位点和 HindIII酶切位点的核苷酸序列如SEQID:1序列。经PCR (聚合酶链式反应)扩 增(实施例1)和双酶切反应(实施例2)后连接到pET32a或者pQE8表达载体 上，从而得到重组表达载体。将重组表达载体转入大肠杆菌宿主BL21或者M15， 于37i:在LB+抗生素的培养基中加入0.4mM IPTG (异丙基-P -D-硫代半乳糖苷) 诱导表达。根据本专利技术，重组表达得到的表达产物具有降血糖生物活性的苦瓜多肽N 端带有多个(至少5个)连续的组氨酸，最优方案采用镍柱亲和洗脱的方式分离 纯化表达产物，步骤少，纯度高，活性损失小。按照本专利技术，融合表达的具有降血糖生物活性的苦瓜多肽和非融合表达的具 有降血糖生物活性的苦瓜多肽均具有显著的降血糖效应(pO.01或p0.05)，采 用pET32a和pQE8表达载体表达该活性多肽对其活性基本没有影响。pET和pQE 载体其他的衍生物均可用于该多肽的表达。本专利技术的另一目的提供了上述具有降血糖生物活性的苦瓜多肽KGP在制备 防治糖尿病药物中的应用。本专利技术人将上述具有降血糖生物活性的苦瓜多肽用生理盐水配置成高、中、 低三个剂量的溶液对糖尿病模型实验动物进行静脉注射，测定不同给药时间动物血糖值，以正常组和模型对照组做参比，确定该苦瓜降糖活性多肽蛋白具有明显 的降血糖作用。本专利技术人用PCR、双酶切和DNA系列测定表明该具有降血糖生物活性的苦 瓜多肽核酸序列约80bp已经整合到表达载体质粒上，SDS-PAGE凝胶电泳图表 明经IPTG诱导后，在预测的目的蛋白分子量大小处有新的蛋白出现，亲和层析 后的样品经SDS-PAGE凝胶电泳检测表现为一条单一的条带。纯化的目的蛋白 苦瓜降糖活性多肽的药理动物实验表明，与模型对照组比较，两种表达载体表达 的蛋白苦瓜降糖活性多肽，在静脉给药4小时后均能显著降低四氧嘧啶糖尿病动 物模型组血糖值，其中表达载体C血糖值p0.05，表达载体D血糖值pO.Ol， 证明目的蛋白苦瓜降糖活性多肽具有明显的降血糖作用。表l不同受试药物对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖值的影响(n=10，组别剂量体重测得血糖值(mmol/L)(mg/kg)(g)给药后0.5h给药后2h给药后4h正常对照组-25.17±1.066.89土0.76A厶6.25士0.96AA5.84士0.82AA模型对照组-23.83±2.2124.62 ±1.99**22.38±2.61**20.98±2.53**二甲双胍组125025.80士2.62厶16.32±2.58**厶厶8.44士3.69AA5.80士4.02A厶c空载体组25.61 ±1.6825.05 ±3.67**23.75±4.14**20.59±4.33**c高剂量组2023.98±3.0825.66±1.72**22.98±2.20**17.08±3.06**厶c中剂量组1025.00±2.6724.32±2.41**22.53 ±2.92**16.75±5.63**厶c低剂量组524.65 ±1.5123.58±2.56**21.84±1.87**18.02±4.71**D高剂量组4.325.00±2.3024.06 ±1.46**22.47±2.33**18.20±4.80**D中剂量组2.123.99±2.0624.76±2.44**本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有降血糖生物活性的苦瓜多肽的基因工程制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：　（１）ＰＣＲ法得到两端带有限制性酶切位点的有如ＳＥＱ　ＩＤ：１寡核苷酸序列的具有降血糖生物活性的苦瓜多肽核苷酸编码序列；并进一步优化为ＳＥＱ　ＩＤ：２ ；　（２）将步骤（１）中得到的具有降血糖生物活性的苦瓜多肽核苷酸序列连结到表达载体中，得到具有降血糖生物活性的苦瓜多肽重组表达载体；　（３）将步骤（２）中得到的具有降血糖生物活性的苦瓜多肽重组表达载体转化到大肠杆菌宿主中，并在表 达步骤（１）中所述的具有降血糖生物活性的苦瓜多肽核苷酸编码序列的条件下，培养被转化的宿主细胞；　（４）从步骤（３）培养的宿主细胞的培养基中和细胞内回收并纯化表达产物具有降血糖生物活性的苦瓜多肽。

【技术特征摘要】
1、一种具有降血糖生物活性的苦瓜多肽的基因工程制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)PCR法得到两端带有限制性酶切位点的有如SEQ ID1寡核苷酸序列的具有降血糖生物活性的苦瓜多肽核苷酸编码序列；并进一步优化为SEQ ID2；(2)将步骤(1)中得到的具有降血糖生物活性的苦瓜多肽核苷酸序列连结到表达载体中，得到具有降血糖生物活性的苦瓜多肽重组表达载体；(3)将步骤(2)中得到的具有降血糖生物活性的苦瓜多肽重组表达载体转化到大肠杆菌宿主中，并在表达步骤(1)中所述的具有降血糖生物活性的苦瓜多肽核苷酸编码序列的条件下，培养被转化的宿主细胞；(4)从步骤(3)培养的宿主细胞的培养基中和细胞内回收并纯化表达产物具有降血糖生物活性的苦瓜多肽。2、 根据权利要求1所述的一种具有降血糖生物活性的苦瓜多肽的基因工程制备方法，其特征在于所述具有降血糖生物活性苦瓜多肽核苷酸编码序列为SEQ ID:2核酸序列的第21个碱基至第75个碱基；其中的SEQ ID:2的第23位、 第35位的密码子为A;第29位、第38位的密码子为T;第68位和第71 位的密码子为A...

【专利技术属性】
技术研发人员：王富军，胡之璧，刘思秀，付中平，周吉燕，
申请(专利权)人：上海中医药大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]