【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于代谢工程领域，涉及一种d-泛酸生产菌的构建方法。
技术介绍
1、d-泛酸(dpa)又称维生素b5、3-吡啶羧酸酰胺，是一种水溶性维生素，广泛存在于动植物中而得“泛酸”之名。在原核生物、真菌、霉菌和植物的细胞内可以通过酶促反应合成，生物体还可以通过依赖na+的多维生素转运体(smvt，又称泛酸透酶)将维生素b5转运到细胞内。维生素b5在体内转变成辅酶a(coa)或酰基载体蛋白(acp)参与脂肪酸代谢反应。泛酸由两部分组成，一部分是2,4-二羟基-3,3-二甲基丁酸，又称泛解酸，另一部分是β-丙氨酸。
2、目前工业上d-泛酸的生产工艺为全化学法和化学酶法组合两种工艺，两种方法都有需要一个重要的中间体dl-泛酸内酯，该中间体合成需要使用剧毒氰化物。随着中国对化工生产环保要求不断升级，日益增长的下游产品需求和上游中间体的限制使得开发一种全新的d-泛酸生产途径成为必要。
3、近年来，利用基因工程菌发酵法生产d-泛酸引起了生物合成领域的极大兴趣，例如cn114181875b公开了以大肠杆菌dpa11为底盘菌，通过代谢工程进行基因改造，得到的大肠杆菌基因工程菌株能够以β-丙氨酸为生物合成反应底物，摇瓶发酵生产d-泛酸的产量达到了6.81g/l。cn113637618b也公开了以大肠杆菌dpa11为底盘菌，通过基因工程改造，得到的工程菌株能够以外源添加的β-丙氨酸为前体底物，通过发酵生产dpa，dpa产量高达66.39g/l，糖酸转化率达30％。cn114908027a公开了以谷氨酸棒杆菌atcc 1303
技术实现思路
1、考虑到大肠杆菌是生长最快的微生物之一，也是基因工程领域研究得最多、遗传背景相对清楚、工业应用最广泛的模式菌种，在通过实验验证发现未能重复出上述专利报道的大肠杆菌工程菌的发酵结果后，专利技术人也基于代谢工程探索了一种新的d-泛酸生产菌构建策略，通过基因工程改造大肠杆菌mg1655，以期获得d-泛酸发酵产量高、遗传性状稳定的基因工程菌，结合紫外诱变技术和环境压迫筛选，获得了一株可以发酵产d-泛酸的大肠杆菌基因工程菌株ecoli w6；在此基础上，对多个基因位点进行启动子替换、插入、敲除等操作，筛选到一株产量明显提升的大肠杆菌基因工程菌株ecoli w12；接着对乙酰羟酸合成酶(ilvbn)进行定向改造筛选，获得酶性能明显改善的突变酶，将其应用于ecoli w12中，获得的工程菌菌种ecoli w21可以有效提高d-泛酸产量及葡萄糖转化率。具体而言，本专利技术包括如下技术方案。
2、一种d-泛酸生产菌，其通过包括以下步骤的方法构建：
3、a.以具有内源d-泛酸代谢途径的大肠杆菌mg1655为底盘菌，弱化或下调d-泛酸下游代谢途径中的泛酸激酶(pantothenate kinase，pantothenic acid kinase)基因coaa(geneid:948479)的表达，得到能通过发酵产生d-泛酸的菌株a，本文中命名为ecoli w1。
4、上述方法中，不敲除、缺失或失活coaa基因(geneid:948479)，因为实验发现敲除或失活宿主菌mg1655基因组中coaa基因后，会严重影响菌株的生长增殖，适得其反，故有必要将coaa基因保持在低表达水平。
5、可选地，步骤a例如通过下述方式实施：
6、a-1.以相对弱的启动子取代宿主菌基因组中调控coaa基因的原启动子coaap(核苷酸序列如seq id no:1所示)：
7、attgcttttcaacgatagcttcctggcagagattttttcttattattcctccc catctggtgttaccctcctgcccattaacccattcaacagaactgtgacgcgcca tggcaaatatcgctttgccgatagagctatgaccgccagaaacatgctt(seq id no:1)；或者
8、a-2.将宿主菌基因组中调控coaa基因的原启动子coaap(核苷酸序列如seq idno:1所示)替换成相对弱的突变启动子coaap*(核苷酸序列如seq id no:2所示)：
9、attgcttttcaacgatagcttcctggcagagattttttcttattattccttac catcttcgtgttaccctcctgcccattaacccattcaacagaactgtgacgcgcc atggcaaatatcgctttgccgatagagctatgaccgccagaaacatgctt(seq id no:2)。
10、上述步骤a中coaa基因的下调表达还可以选自下组方式：蛋白泛素化修饰，rna干涉(rnai)，表达系统发生结构改变，转录水平发生负性调控，转录后水平发生负性调控，基因的转录降低，基因的翻译降低，蛋白质降解的增强，它们中两种以上的组合。
11、菌株a的d-泛酸发酵产量比较低，没有工业化应用的可能。因此必须提高其d-泛酸合成能力。
12、进一步地，上述方法还包括以下步骤：
13、b.对菌株a进行诱变和水杨酸环境压力筛选，获得d-泛酸生物合成能力提高即发酵产量提高100％以上、优选150％以上、更优选200％以上的菌株b，本文中命名为ecoliw6。
14、优选地，上述的方法还可以包括以下步骤：
15、c.使菌株a或菌株b、尤其菌株b是过表达ilvc、ilvd、panb、pane和panc基因，得到d-泛酸生物合成能力进一步提高即发酵产量提高100％以上、优选150％以上、更优选200％以上的菌株c，本文中命名为ecoli w12。
16、其中ilvc和ilvd属于氨基酸合成途径和d-泛酸合成途径重要蛋白；panb、pane和panc属于d-泛酸合成途径重要蛋白。
17、在一种实施方式中，上述步骤c可以通过下述方式实施：
18、分别构建包含ilvc、ilvd、panb、pane和panc多顺反子，采用大肠杆菌多拷贝整合型基因组编辑技术mucicat系统在宿主菌基因组的avta、ilva、ilve和lac z位点进行上述基因ilvc、ilvd、panb、pane和panc多顺反子的插入。
19、为了克服高浓度缬氨酸和亮氨酸对于d-泛酸生物合成反应的影响，有必要提高大肠杆菌来源的乙酰羟酸合成酶ilvbn的酶活力。
20、优选地，上述方法还包括以下步骤：
21、d.使菌株c过表达核苷酸序列如seq id no:5所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种D-泛酸生产菌，其特征在于，通过包括以下步骤的方法构建：
2.如权利要求1所述的D-泛酸生产菌，其特征在于，步骤A通过下述方式实施：
3.如权利要求1所述的D-泛酸生产菌，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：
4.如权利要求1或2所述的D-泛酸生产菌，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：
5.如权利要求4所述的D-泛酸生产菌，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：
6.如权利要求5所述的D-泛酸生产菌，其特征在于，其为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.29714。
7.如权利要求5中所述的乙酰羟酸合成酶ilvBN突变体，其特征在于，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的乙酰羟酸合成酶大亚基ilvB突变体。
8.编码如权利要求7中所述乙酰羟酸合成酶ilvBN突变体的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
9.如权利要求7中所述乙酰羟酸合成酶大亚基ilvB突变体、或者
10.如权利要求1-6中任一项所述D-泛酸生产菌在以葡萄糖为碳源生产D-泛酸中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种d-泛酸生产菌，其特征在于，通过包括以下步骤的方法构建：
2.如权利要求1所述的d-泛酸生产菌，其特征在于，步骤a通过下述方式实施：
3.如权利要求1所述的d-泛酸生产菌，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：
4.如权利要求1或2所述的d-泛酸生产菌，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：
5.如权利要求4所述的d-泛酸生产菌，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：
6.如权利要求5所述的d-泛酸生产菌，其特征在于，其为大肠埃希氏菌(escherichiacoli)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.297...
【专利技术属性】
技术研发人员：王金刚，梁岩，任亮，步绪亮，韦炎龙，
申请(专利权)人：上海邦林生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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