用毕赤酵母表达系统制备抗人乳头瘤病毒18型感染的疫苗的方法技术方案

本发明专利技术公开了一种利用毕赤酵母表达系统制备重组人乳头瘤病毒１８型Ｌ１蛋白的方法，包括将按照优化设计的ＨＰＶ　１８　Ｌ１基因装入表达载体，转化毕赤酵母，培养转化体，获得重组的人乳头瘤病毒１８型Ｌ１蛋白，该蛋白在毕赤酵母体内自组装成病毒样颗粒；其中，所述的优化设计的ＨＰＶ　１８　Ｌ１基因的核苷酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．３、ＳＥＱ　ＩＤＮＯ．４、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．５或ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．６所示。本发明专利技术的方法制备的ＨＰＶ　１８　Ｌ１蛋白表达量高。本发明专利技术还公开了将该重组ＨＰＶ　１８　Ｌ１蛋白病毒样颗粒制成抗人乳头瘤病毒１８型感染的疫苗的方法。该疫苗具有较佳的活性。

Method for preparing a vaccine against human papillomavirus type 18 infection by using Pichia pastoris expression system

The invention discloses a method for using the Pichia pastoris expression system of recombinant human papillomavirus type 18 L1 protein, including the expression vector will be in accordance with the optimization design of HPV 18 L1 gene into the Pichia pastoris transformed, culturing the transformant, recombinant human papillomavirus type 18 L1 protein, the protein in the Pichia pastoris in vivo self assemble into virus like particles; wherein, the nucleotide sequence of the optimization design and the HPV of the 18 L1 gene is shown as SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ IDNO.4, SEQ ID NO.5 or SEQ ID NO.6. The HPV 18 L1 protein prepared by the method of the invention has high expression quantity. The invention also discloses a method for making the recombinant HPV 18 L1 protein virus like granule to be a vaccine against human papilloma virus type 18. This vaccine has better activity.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用毕赤酵母表达系统制备重组人乳头瘤病毒18型L1蛋白及用该L1蛋白制备抗人乳头瘤病毒18型感染的疫苗的方法。
技术介绍
人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus， HPV)是乳多空病毒科多瘤病毒亚科的一个无包膜的小型双链环状DNA病毒。HPV可通过人体间的密切接触传播，引起被感染者的皮肤出现寻常疣和肛门生殖器尖锐湿疣等病变，被列为性传播疾病。1995年，国际癌症研究中心公布的研究结果证实，HPV与宫颈癌有密切的因果关系。由此可见，HPV感染已成为严重危害人类健康的病原体。因此，研制高效、廉价的HPV疫苗，对于预防女性宫颈癌和HPV感染所引起的性传播疾病具有十分重要的意义。根据HPV亚型与女性生殖道恶性肿瘤的关系，将HPV分为低危型和高危型。HPV6、 11、 34、 40、 42等型别多见于良性宫颈病变如宫颈湿疣及宫颈上皮轻度不典型性增生病变中，属HPV低危型；而宫颈上皮重度不典型增生及宫颈癌中以HPV16、 18、 31、 33、 35、 39、 45型感染更为多见，这些亚型为高危型。不同人群中一系列的研究已证实生殖道的HPV 16、 18型感染与宫颈癌的发生高度相关，较其他危险因素更密切。因此HPV16、 18型的疫苗的开发将能够有效的预防宫颈癌的发生。HPV是一种DNA病毒，直径约为45 55nm，呈球形，无包膜，衣壳为由72个壳微粒组成对称偏斜的20面体。其病毒颗粒衣壳由主要衣壳蛋白(Ll)和次要衣壳蛋白(L2)组成。主要衣壳蛋白L1在细胞中表达后能自动组装成衣壳颗粒，称为病毒样颗粒(VLPs)，该颗粒与天然病毒有相似的空间构象、免疫特性和生物学活性，并可以大规模制备和纯化，因而基于Ll衣壳蛋白的VLP预防性疫苗的开发成为目前HPV疫苗研究的主要方向。目前，Merck公司的预防型HPV四价疫苗(商品名Gardasil)已经上市。该疫苗为酿酒酵母系统表达的HPV 16+18+6+11 Ll蛋白，临床实验表明Merck疫苗在预防16型、18型、6型(6a和6b)、 ll型HPV感染的有效率接近100%。 GlaxoSmithKline公司的预防型HPV双价疫苗(商品名为Cervarix，昆虫细胞表达的HPV16+18L1蛋白)也己经进入FDA审批阶段，已获准在澳大利亚、欧盟、菲律宾、阿联酋等地上市。毕赤酵母(i^/2//7wton^)表达系统具有操作简单、易于培养、表达量高、成本低等优点，还具有原核生物表达系统所不具有的对外源蛋白的翻译后修饰等特点，如糖基化、蛋白磷酸化等。同时它还避免了酿酒酵母分泌效率差、表达菌株不够稳定、表达质粒易丢失等缺陷。毕赤酵母中加到外源蛋白每条侧链的平均长度为8~14个甘露糖残基，较之酿酒酵母每条侧链平均50-150甘露糖残基要短得多。专利CN1869215A公开了一种利用毕赤酵母表达系统制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法，分别将用PCR扩增宫颈癌病理组织标本得到的编码人乳头瘤病毒晚期蛋白的基因克隆到毕赤酵母分泌表达载体中，构建重组毕赤酵母细胞；利用重组毕赤酵母细胞进行发酵培养和甲醇诱导分泌表达Ll蛋白，培养上清经纯化后，所得L1蛋白可自组装成病毒样颗粒，但该文献未公开该根据毕赤酵母密码子的偏爱性合成的HPVL1基因的核苷酸序列以及重组L1蛋白的活性。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的问题就是提供一种表达量高的用毕赤酵母表达系统制备重组人乳头瘤病毒18型L1 (HPV 18L1)蛋白的方法。本专利技术还要解决的问题是提供用所述重组HPV 18 Ll蛋白制备抗HPV 18感染的疫苗的4方法，制得的疫苗具有较佳活性。本专利技术人经过深入而广泛的研究，成功的建立了用优化密码子的基因在毕赤酵母表达系统中高量表达病毒样颗粒和制备抗人乳头瘤病毒18型疫苗的技术，在此基础上完成了本专利技术。首先，本专利技术人经过仔细的研究，设计了适用毕赤酵母偏好密码子的人乳头瘤病毒18型基因的核苷酸序列。遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。毕赤酵母和人的基因对密码子的利用有各自的偏爱。由于遗传密码是简并的，每个氨基酸都由一个以上的密码子编码，同一氨基酸的密码子在野生型的基因中的使用频率是不同的。毕赤酵母的密码子偏好可能导致重组蛋白低的翻译效率和表达水平。由于现有技术中，N端缺失61个氨基酸的编码核苷酸序列的截短型HPV 18 Ll基因更有利于在重组载体中进行表达，故本专利技术人对野生型的全长HPV18L1基因(GenebankAAP20601)以及上述截短型HPV18L1基因(GenebankAAQ92369)进行改造对其所有的氨基酸全部采用使用频率最高的密码子。Pichia酵母密码子使用频率见表1，该数据来源为http:〃www.kazusa.or.jp/codon/。然后在此基础上，又为了避免翻译出来的mRNA的GC比例过高，mRNA的二级结构影响翻译的效率和一些常用的酶切位点，本专利技术人对最高频率的密码子进行一定的修正。由此，本专利技术人优化设计出若干种适于毕赤酵母表达的HPV 18 Ll基因的核苷酸序列，按照所述的序列全合成了全长及该基因的截短型HPV18L1基因，将其克隆到现有毕赤酵母表达载体中，通过同源重组及高浓度抗生素的筛选构建重组毕赤酵母表达菌株；利用重组毕赤酵母进行发酵培养和甲醇诱导胞内表达HPV 18 Ll蛋白。从中筛选出6种全新的HPV 18 Ll基因的核苷酸序列，可在毕赤酵母中高表达HPV 18 Ll蛋白，并在胞内同时形成病毒样颗粒(VLPs)，破菌上清经过层析方法纯化后，纯化的病毒样颗粒纯度大于90%，吸附铝佐剂后，具有极高的免疫原性，可作为人用预防宫颈癌的疫苗。这些优化设计的全长HPV 18 Ll基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.l 、SEQ ID NO.25或SEQ ID NO.3所示，其相应的截短型HPV 18 LI基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.4、 SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。表1 Pichia酵母密码子表<table>table see original document page 6</column></row><table>然后，本专利技术利用上述6种全新的适于毕赤酵母表达的全长或截短型 HPV18L1基因的核苷酸序列，可以采用现有常规的分子生物学技术，构建 了基因工程菌，并发酵培养工程菌，分离纯化得到重组的HPV18L1蛋白。 其中，本专利技术基因工程菌的构建方法根据毕赤酵母密码子的偏爱性，全基因合成上述优化设计的全长或截短 型病毒HPV 18衣壳蛋白L1基因，克隆至毕赤酵母表达载体中，所用的表 达载体选自pPICZ、 pPIC6、 pGAPZ和pA0815等现有常用的毕赤酵母表达 载体，将含HPV18L1基因的表达载体转化毕赤酵母宿主菌株，通过筛选获 得重组毕赤酵母工程菌，转化方法可用电转化或原生质体转化，所用的宿主 酵母菌选自现常用的毕赤酵母X-33、 GS115、 KM71和SMD1168等菌株。本专利技术基因工程菌的发酵方法将本专利技术基因工程菌接入活化培养基(YPD或LB或SOC)， 25 37r培 养过夜。将镜检合格的活化液接入种子本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）表达系统制备重组人乳头瘤病毒１８型Ｌ１蛋白的方法，其包括将优化设计的ＨＰＶ　１８　Ｌ１基因克隆至表达载体，转化毕赤酵母菌株，培养转化体，获得重组的ＨＰＶ　１８　Ｌ１蛋白；其中，所述的优 化设计的ＨＰＶ　１８　Ｌ１基因的核苷酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１、ＳＥＱ　ＩＤＮＯ．２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．３、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．４、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．５或ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．６所示。

【技术特征摘要】
1、一种利用毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统制备重组人乳头瘤病毒18型L1蛋白的方法，其包括将优化设计的HPV18L1基因克隆至表达载体，转化毕赤酵母菌株，培养转化体，获得重组的HPV18L1蛋白；其中，所述的优化设计的HPV18L1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。2、 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的表达载体选自质粒 pPICZ、 pPIC6、 pGAPZ和pA0815。3、 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的转化用电转化或原 生质体转化。4、 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的毕赤酵母菌株选自 毕赤酵母X-33、 GS115、 KM71和SMD1168...

【专利技术属性】
技术研发人员：张高峡，雷建强，袁靖宇，张梦华，熊莹华，沈琼，吴克，
申请(专利权)人：上海泽润生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]