【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一种多形汉逊酵母中游离在染色体外的稳定质粒的构建方法。
技术介绍
1、多形汉逊酵母(hansenula polymorpha)属于甲醇营养型酵母，是公认安全的微生物(generally regarded as safe,grad)。多形汉逊酵母作为单细胞低等真核生物，易培养，繁殖快，可利用多种底物，无毒性代谢产物，可耐受50℃高温，对金属胁迫和氧胁迫等多种环境胁迫具有更高的耐受性；特别的，多形汉逊酵母具有与高等真核生物相似的蛋白修饰机制，在重组蛋白翻译后修饰的过程中进行适度糖基化可降低免疫原性，这些特点使其成为生产医药用蛋白的重要宿主，多形汉逊酵母表达系统近年来迅速发展成为生物工程领域中备受关注的细胞工厂之一。
2、多形汉逊酵母菌株基因组测序和部分注释也已经完成，但在多形汉逊酵母中的已报道质粒基本都为整合质粒，个别质粒能以游离状态暂时存在，但极不稳定，后期会整合到基因组上。由于多形汉逊酵母菌株体内缺乏稳定复制的游离质粒，在多形汉逊酵母遗传操作中，首先需将目标蛋白表达盒连入质粒并将质粒线性化后再进行转化，通过质粒上的同源dna片段定点整合到基因组的特定位置。多形汉逊酵母体内主要存在的是非同源性末端接合途径(nhej)的dna双链缺口修复系统，外源基因的整合大都是随机整合到基因组上，同源重组率低，这就需要大量的后续实验来验证外源基因是否正确整合到所设计的基因组特定位点上。多形汉逊酵母中缺乏稳定的游离质粒限制了它在代谢工程和合成生物学方面的应用。
技术实现思路b>
1、本专利技术所要解决的技术问题是如何在多形汉逊酵母中构建稳定的游离质粒，以及如何利用构建的质粒表达不同来源(外源)的蛋白。
2、着丝粒是真核生物染色体上的重要功能元件。在不同的物种中，着丝粒染色质的结构具有多样性，着丝粒的序列和大小都差异显著。多形汉逊酵母菌株dl-1的7条染色体中间有一段10-20kb的at富集区，只有极少的蛋白编码基因，推测可能为多形汉逊酵母的着丝粒区。本专利技术通过在多形汉逊酵母中挖掘其着丝粒及其相邻的自主复制序列，以此为基础构建在多形汉逊酵母中可以游离在染色体外的稳定质粒。
3、为了解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种多形汉逊酵母中游离在染色体外的稳定质粒，所述质粒为环形双链dna分子，所述质粒含有选择性标记基因表达盒、大肠杆菌复制起点ori、乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因表达盒、用于启动外源基因转录的启动子、多形汉逊酵母着丝粒序列和自主复制序列。
4、上述质粒中，所述质粒还含有用于插入外源基因的多克隆位点。
5、上述质粒中，所述选择性标记基因可为氨苄青霉素抗性基因(ampr)，可用于大肠杆菌中质粒的筛选，具体所述选择性标记基因表达盒的核苷酸序列可如seq idno.1第4267-5402位所示，其中第5298-5402位为ampr启动子，第4437-5297位为氨苄青霉素抗性基因ampr，第4267-4436位为ampr终止子。
6、上述质粒中，所述大肠杆菌复制起点ori的核苷酸序列可如seq id no.1第3678-4266位所示。
7、上述质粒中，所述乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因表达盒为表达氨基酸序列是seqid no.5的蛋白质的双链dna分子。
8、上述质粒中，所述乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因表达盒的核苷酸序列可如seqid no.1第397-1701位所示，其中第397-678位为hpura3启动子，第679-1470位为乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因(hpura3)的编码序列(cds)，编码氨基酸序列为seq id no.5的蛋白质，第1471-1701位为hpura3终止子。
9、上述质粒中，所述用于启动外源基因转录的启动子可为组成型启动子，具体可为启动子gapp，所示启动子gapp的核苷酸序列可如seq id no.1第1702-2497位所示。
10、上述质粒中，所述多形汉逊酵母着丝粒序列和自主复制序列为如下任一种：
11、a1、多形汉逊酵母5号染色体的着丝粒序列和自主复制序列；
12、a2、多形汉逊酵母1号染色体的着丝粒序列和自主复制序列；
13、a3、多形汉逊酵母2号染色体的着丝粒序列和自主复制序列。
14、上述质粒中，所述多形汉逊酵母5号染色体的着丝粒序列和自主复制序列为seqid no.2；所述多形汉逊酵母1号染色体的着丝粒序列和自主复制序列为seq idno.3；所述多形汉逊酵母2号染色体的着丝粒序列和自主复制序列为seq id no.4的。
15、上述质粒中，所述质粒一条链的核苷酸序列为如下任一种：
16、b1、为将seq id no.1第171-396位替换为seq id no.2，保持seq id no.1其它序列不变；
17、b2、为将seq id no.1第171-396位替换为seq id no.3，保持seq id no.1其它序列不变；
18、b3、为将seq id no.1第171-396位替换为seq id no.4，保持seq id no.1其它序列不变。
19、为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了一种dna分子，所述dna分子由多形汉逊酵母着丝粒序列和自主复制序列组成。
20、上述dna分子中，所述dna分子的核苷酸序列为如下任一种：
21、c1、为seq id no.2；
22、c2、为seq id no.3；
23、c3、为seq id no.4。
24、本专利技术还提供了生物材料，所述生物材料为含有权利要求7或8所述dna分子的表达盒、载体或重组微生物。
25、为构建多形汉逊酵母中游离在染色体外的稳定质粒，本专利技术还提供了初始质粒，所述质粒为环形双链dna分子，所述质粒含有选择性标记基因表达盒、大肠杆菌复制起点ori、乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因表达盒、用于启动外源基因转录的启动子、和laczα编码序列。
26、所述laczα编码序列的核苷酸序列可为seq id no.1的第171-396位。
27、所述初始质粒可为质粒pgg，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
28、本专利技术还提供所述的dna分子和/或所述初始质粒在构建游离在染色体外的质粒中的应用。
29、本专利技术还提供一种能在多形汉逊酵母中游离在染色体外的稳定质粒的构建方法，包括如下步骤：以多形汉逊酵母着丝粒序列和自主复制序列替换初始质粒的laczα编码序列，保持初始质粒的其它序列不变，获得能在多形汉逊酵母中游离在染色体外的稳定质粒。
30、上述方法中，所述方法具体可包括如下步骤：以多形汉逊酵母着丝粒序列和自主复制序列替换质粒pgg中seq id no.1的第171-396位序列，保持质粒pgg的其它序列不变，获得能在多形汉逊酵母中游离在本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种质粒，其特征在于：所述质粒为环形双链DNA分子，所述质粒含有选择性标记基因表达盒、大肠杆菌复制起点ORI、乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因表达盒、用于启动外源基因转录的启动子、多形汉逊酵母着丝粒序列和自主复制序列。
2.根据权利要求1所述的质粒，其特征在于：所述乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因表达盒为表达氨基酸序列是SEQ ID No.5的蛋白质的双链DNA分子。
3.根据权利要求1-2任一所述的质粒，其特征在于：所述多形汉逊酵母着丝粒序列和自主复制序列为如下任一种：
4.根据权利要求3所述的质粒，其特征在于：所述多形汉逊酵母5号染色体的着丝粒序列和自主复制序列为SEQ ID No.2；所述多形汉逊酵母1号染色体的着丝粒序列和自主复制序列为SEQ ID No.3；所述多形汉逊酵母2号染色体的着丝粒序列和自主复制序列为SEQ IDNo.4的。
5.根据权利要求4所述的质粒，其特征在于：所述质粒一条链的核苷酸序列为如下任一种：
6.DNA分子，其特征在于：所述DNA分子由多形汉逊酵母着丝粒序列和多形汉逊酵母的自主复制序列
7.根据权利要求6所述DNA分子，其特征在于：所述DNA分子的核苷酸序列为如下任一种：
8.初始质粒，其特征在于：所述初始质粒为如SEQ ID No.1。
9.构建权利要求1-5任一所述质粒的方法，其特征在于：包括如下步骤：以多形汉逊酵母着丝粒序列和自主复制序列替换SEQ ID No.1的第171-396位序列，保持SEQ ID No.1其它序列不变，获得构建权利要求1-5任一所述质粒。
10.权利要求6或7所述的DNA分子和/或权利要求8所述初始质粒和/或权利要求9所述方法在构建游离在染色体外的质粒中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种质粒，其特征在于：所述质粒为环形双链dna分子，所述质粒含有选择性标记基因表达盒、大肠杆菌复制起点ori、乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因表达盒、用于启动外源基因转录的启动子、多形汉逊酵母着丝粒序列和自主复制序列。
2.根据权利要求1所述的质粒，其特征在于：所述乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因表达盒为表达氨基酸序列是seq id no.5的蛋白质的双链dna分子。
3.根据权利要求1-2任一所述的质粒，其特征在于：所述多形汉逊酵母着丝粒序列和自主复制序列为如下任一种：
4.根据权利要求3所述的质粒，其特征在于：所述多形汉逊酵母5号染色体的着丝粒序列和自主复制序列为seq id no.2；所述多形汉逊酵母1号染色体的着丝粒序列和自主复制序列为seq id no.3；所述多形汉逊酵母2号染色体的着丝粒序列和自主复制序列为seq idno....
【专利技术属性】
技术研发人员：程艳飞，郭雪娜，石媛媛，何秀萍，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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