基因导入材料及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种基因导入材料，它为碳酸钙和植酸钙组成的复合材料，平均粒径为２００纳米左右，其中碳酸钙含量为８０％，植酸钙含量为２０％。本发明专利技术还公开了一种基因导入材料的制备方法。本发明专利技术的基因导入材料具有较高的转染效率，在人血管平滑肌细胞中可以达到４０％左右；低毒性，因碳酸钙具有良好的生物相容性，细胞生存率很高；材料分散性良好，符合对转染的要求；非常低的成本，植酸是食品添加剂，成本很低，另外实验中使用的化学药品，氯化钙和氨水都是常见廉价试剂；材料制备反应简单易操作，可重复性好。

Gene introduction material and preparation method

The invention discloses a gene into materials, composite materials for calcium carbonate and calcium phytate. The average particle size of 200 nm, the content of calcium carbonate is 80%, calcium phytate content is 20%. The invention also discloses a preparation method of the gene introduction material. The invention of the gene material has high transfection efficiency in human vascular smooth muscle cells can reach about 40%; low toxicity due to calcium carbonate has good biocompatibility, cell survival rate is high; the material has good dispersibility, consistent with the transfection requirements; very low cost, phytic acid is a food additive, cost very low, also used in the experiment of chemical drugs, calcium chloride and ammonia are common cheap reagents; material preparation was simple and easy to operate, good repeatability.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因导入技术。
技术介绍
基因导入系统或方法可以分为两类病毒型基因导入系统，以逆转录病毒、腺病 毒、腺相关病毒为载体；非病毒型基因导入，如显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀、阳离子脂 质体法、以及新兴的纳米基因导入材料。由于病毒型基因导入系统存在许多严重的不足，如 病毒转染有可能激活原癌基因等，故非病毒型转染方式是目前的研究热点，在上述非病毒 式转染中，显微注射一次只能处理一个细胞；基因枪穿透力十分有限；磷酸钙共沉淀法结 果不稳定；仅阳离子脂质体法表现了良好的转染效率，但是过高的毒性又限制了它的应用。
技术实现思路
针对现有技术的缺点，本专利技术提供一种，具有良好的细 胞相容性和稳定且较高的转染效率。 为了实现上述目的，本专利技术基因导入材料的技术方案为一种基因导入材料，它为 碳酸钙和植酸钙组成的复合材料，平均粒径为200纳米左右，其中碳酸钙含量为80%，植酸 钙含量为20%。 所述基因导入材料和绿色荧光蛋白质粒基因pGFP以非共价方式结合形成基因导 入系统，用于基因转染。 制备基因导入材料的方法为包括如下步骤(l)取分析纯的氯化钙、碳酸铵在乙 醇中超声，然后依次用双蒸水、洗液、双蒸水、丙酮清洗，最后在空气中晾干；(2)用去离子 水溶解氯化f丐制备0. 01M新制的氯化f丐溶液；(3)在80mL0. 01M氯化f丐溶液中加入80mg植 酸，搅拌混匀后将其分装在4个烧杯中，所述每个烧杯中装有0. 25mL植酸，起始浓度为lg/ L，起始ra二 3.0 ;(4)将所述烧杯用parafilm封口，并在parafilm上对称地扎三个针眼。 放置于干燥器上层，干燥器下层摆放3个对称放置的10mL小烧杯，每个小烧杯中装满研磨 细的碳酸铵粉末，小烧杯也以parafilm封口，并在parafilm上对称地扎三个针眼；(5)盖 上干燥器盖进行扩散法反应；(6) 6小时后取出样品，在8000r/m速度离心，之后用双蒸水洗 至ra = 7，再用乙醇洗，然后在室温下晾干。 与现有技术相比，本专利技术的基因导入材料具有以下优点(l)具有较高的转染效 率，在人血管平滑肌细胞中可以达到40%左右；(2)低毒性，因碳酸钙、磷酸钙都具有良好 的生物相容性，细胞生存率很高；(3)材料分散性良好，符合对转染的要求；(4)非常低的成 本，植酸是食品添加剂，成本很低，另外实验中使用的化学药品，氯化钙和氨水都是常见廉 价试剂；(5)材料制备反应简单易操作，可重复性好。附图说明 图1为本专利技术基因导入材料的扫描电镜图片； 图2为基因导入材料的投射电镜图片； 图3为转染后的倒置荧光显微镜下的荧光图片； 图4为转染后的细胞生存率图片； 图5为转染效率图； 图6为转染试验图。 图7为绿色莹光蛋白(GFP)基因表之图。 具体实施例方式—、本专利技术基因导入材料(ACC，经过植酸钙修饰后功能化的纳米无定形碳酸钙) 的制备 1、原料准备 分析纯的氯化f丐、碳酸铵、植酸(分子量，丽660)，前述原料均是Aldrich公司产 品。所有的原料制备用玻璃器皿，均在乙醇中超声5分钟，然后双蒸水清洗，并用洗液1120/ HN03(65% )/H202 (35% ) (1 : 1 : 1，v/v/v)清洗，之后再用双蒸水、丙酮依次清洗，最后在 空气中晾干。 2、基因导入材料制备方法 用去离子水溶解氯化*丐制备0. 01M新制的氯化^溶液，首先，在80mL0. OIM氯化牵丐 溶液中加入80mg植酸，搅拌混匀后，将其分装在4个25mL的烧杯中，每个烧杯中20mL，起始 植酸浓度为lg/L，起始PH = 3. 0。 25mL烧杯用paraf ilm封口 ，并在paraf ilm上对称地扎 三个针眼。放置于干燥器上层，干燥器下层摆放3个对称放置的10mL小烧杯，每个烧杯中 装满研磨细的碳酸铵粉末，烧杯以parafilm封口，并在parafilm上对称地扎三个针眼。盖 上干燥器盖进行扩散法反应。6小时后取出样品，在8000r/m速度离心，之后用双蒸水洗至 ra = 7，乙醇洗，最终样品在室温下晾干。请参阅图1和图2，分别为ACC的扫描电镜SEM和 透射电镜TEM图。 二、结合性能的测定 1、主要材料 绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-Cl) ;HEPES平衡盐溶液(自配)；电泳缓冲液 (0. 5XTBE，自配);DNA上样缓冲液；溴化乙啶(EB)。 2、主要方法 1 ii LACC溶液(5mgACC溶解在500 y L双蒸水中)与1 y LpEGFP-Cl水溶液 (0. 1 ii g/ ii L)以及8 iil双蒸水(pH = 7. 4water)在1. 5mL离心管中混合，置于室温下30分钟让其充分结合。Acc和pEGFP-ci的质量比分别用ioo : 1，50 : 1，30 : i，io : i，1:1。在5000rpm的速度下离心5min。将沉淀物加载到1 %的琼脂糖(EBO. 1 y g/mL)在 TAE的缓冲下，在100V电压下跑40min，然后在320nm处观察条带。 3、结果 结果观察，有多种条带出现，这是因为pEGFP-Cl有多种构型所致。在质量比30 : i，io : i，i : i处条带清晰明显，说明在这些质量比之下，DNA和纳米颗粒结合不是 很好，到了ioo : 1，50 : i条带消失，说明结合完全了。 这些结果表明带正电荷的pEGFP-Cl和ACC有一个最佳的结合比，超出50 : l以后过多的纳米颗粒显得不再重要，所以使用50 : i进行转染。 三、转染 1、主要材料 人血管平滑肌细胞(HUSMC) ;ACC@pEGFP-Cl联合体(上述制备)；DMEM培养基；胎牛血清FBS;6孔培养板。 2、主要方法 (1)细胞的培养将HUSMC用胰蛋白酶-EDTA消化下来，计数后加入到6孔板中 (5 X 106/孔)，用含FBS10 %的DMEM溶液并加转染优化试剂培养至细胞密度为60 % 70 % 的融合度。 (2)细胞转染实验将培养好的细胞上清除去，换新的培养液并加入质量比50 : 1 的ACC@pEGFP-Cl联合体，培养48小时后分别对其荧光、细胞存活率(碘化吡啶标识，流式 细胞仪检测)、转染效率(流式细胞仪检测)进行测定。 3、结果分析 请参阅图3，荧光图可以看出有明显绿色荧光，并且覆盖面比较大；请参阅图4，分 别为无添加物、ACC@pEGFP-Cl联合体、lipofectamine 2000@ pEGFP-Cl联合体的生存率， 可以看到ACC@pEGFP-Cl联合体对细胞生存率的影响是很小的。比lipofectamine 2000@ pEGFP-Cl联合体的影响小很多。请参阅图5，可以看到ACC@pEGFP-Cl联合体可以达到约 40%的转染效率，这是在保证了细胞生存率的前提下达到了一个如此的转染效率。虽然不 及lipofectamine 2000高，但是其高细胞相容性是lipofectamine 2000所无法比拟的，表 现出了 ACC做为转染试剂的巨大潜力；请参阅图6，在转染试验中，碳酸钙颗粒与DNA结合并将其转入到人主动脉平滑肌细胞中，通过荧光显微镜，在细胞内观察到绿色荧光。 综上，由碳酸钙等生物相容性好且低毒的材料组成的复合材本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因导入材料，其特征在于，它为碳酸钙和植酸钙组成的复合材料，平均粒径为２００纳米左右，其中碳酸钙含量为８０％，植酸钙含量为２０％。

【技术特征摘要】
一种基因导入材料，其特征在于，它为碳酸钙和植酸钙组成的复合材料，平均粒径为200纳米左右，其中碳酸钙含量为80％，植酸钙含量为20％。2. 根据权利要求l所述的基因导入材料，其特征在于，它和绿色荧光蛋白质粒基因 pGFP以非共价方式结合形成基因导入系统，用于基因转染。3. —种基因导入材料的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤(1) 取分析纯的氯化钙、碳酸铵在乙醇中超声，然后依次用双蒸水、洗液、双蒸水、丙酮 清洗，最后在空气中晾干；(2) 用去离子水溶解氯化钙制备0. 01M新制的氯化钙溶液；(3) 在80mL0. 01M氯化f丐溶液中加...

【专利技术属性】
技术研发人员：王深明，周鸿雁，徐安武，叶财盛，张德元，刘勇，胡作军，王冕，常光其，
申请(专利权)人：王深明，徐安武，张德元，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]