【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及高通量定量pcr芯片领域。
技术介绍
1、微生物水平基因转移由可移动遗传元件(mges)如插入元件、质粒、转座子、整合子、整合和结合元件、基因岛、和噬菌体等介导完成，这些可移动遗传元件作为功能基因的载体，促进基因在微生物群落中的快速扩散。
2、插入元件是最简单的转座子，通常是0.7至3.5kbp大小的紧凑遗传转座dna片段，由末端反向重复序列和编码转座酶的基因组成，以不同数量的拷贝广泛存在于细菌的基因组和质粒中，截止2023年2月，isfinder数据库记录了5800余种插入元件，分属于30个家族。插入元件在转座酶的介导下，基因组发生扩增或减少导致基因缺失、倒置和重排，促进细菌的正向选择和进化。此外，插入元件可以插入基因的内部或附近，对细菌耐药性、毒力和异源物质代谢等多种生命过程产生重要影响。因此，插入元件可以通过激发不同物种间基因交流的潜力，增加基因组的可塑性，为细菌生存提供适应性策略。
3、环境中的抗生素耐药基因、异源物质降解基因等在插入元件等mges的介导下传播和扩散可协助微生物缓解生存压力，影响细菌种属的生态学及致病性特征乃至环境生态风险。近年来伴随抗生素的广泛使用，抗生素耐药基因借助mges在全球的快速传播即是水平基因转移最为显著的案例。抗生素耐药性已被世界卫生组织认定为对公共卫生和食品安全的重大全球威胁。目前，每年数十万人死于耐抗生素细菌引起的感染，这突显了抗生素耐药性在全球范围内对人类健康的巨大影响。另一方面，随着农药等人造化学物质的持续使用，异源物质在环境中积累，细菌等微生物
4、插入元件及其介导的耐药基因、异源物质降解基因等相关研究首先需要明确环境中相关插入元件的丰度和组成。然而当前的研究多集中于耐药基因等功能基因的组成和丰度，插入元件作为介导多种功能基因水平转移的主要可移动遗传元件，却未受到足够的关注。主要的挑战在于，插入元件种类繁多，且同一种菌可能含有单拷贝或多拷贝的不同插入元件。
5、目前对于插入元件的研究主要基于单个细菌菌株的分离或基因组数据库的收集，而不同环境中的菌群组成不同，插入元件的丰度和组成也会有很大差异。针对不同插入元件设计特异性引物，进行荧光定量pcr，是目前对环境中插入元件进行定量的手段之一。而现有研究中关于插入元件的特异性引物极少，且现有引物对的目的片段过长，不适合用于定量pcr。
技术实现思路
1、针对现有技术当中存在的问题，本专利技术公开了一种可检测多种插入元件的定量pcr引物组合物，所述的引物组合物包括：
2、第一引物组合物，其包括有109个引物对，所述的109个引物对分别由seq id no：1～109所记载单链dna和与之对应的seq id no：120～228所记载的单链dna组成；
3、第二引物组合物，其包括有5个引物对，所述的5个引物对由seq id no：110～114所记载单链dna和与之对应的seq id no：229～233所记载的单链dna组成；
4、第三引物组合物，其包括有5个引物对，所述的5个引物对由seq id no：115～119所记载单链dna和与之对应的seq id no：234～238所记载的单链dna组成。
5、所述的第一引物组合物用于检测抗生素耐药基因相关插入元件；所述的第二引物组合物用于检测异源物质降解基因相关插入元件；所述的第三引物组合物能够用于同时检测抗生素耐药基因和异源物质降解基因相关插入元件。
6、本专利技术还公开了一种可检测多种插入元件的高通量实时荧光定量pcr芯片，所述的芯片包括上述所述的定量pcr引物组合物。
7、在改进的方案当中，高通量实时荧光定量pcr芯片，还包括有样品dna和无核酸酶灭菌水。
8、本专利技术还公开了一种权利要求2所述的高通量定量pcr芯片的制备方法，步骤如下：
9、s1:按照仪器120assays*42samples的排布说明，分别制备384孔“酶-引物混合板”和“酶-样品混合板”，具体为：将911μl 2×sybr green i mix酶和547μl pcr级无菌水先进行混合，再将混合液用排枪加入到384板中的120个孔中，每孔10.9μl，再分别向120个孔中加入2.7μl 120种引物对的引物溶液(10μm)，所述的120种引物对包括所述的119种引物对，以及一个看家基因16s rrna基因的引物对，所述看家基因16s rrna基因的引物对如seq idno：239-240所示，至此，得到120组“酶-引物混合板”；将493μl 2×sybr green i mix酶和296μl pcr级无菌水先进行混合，再将混合液用排枪加入到384板中的42个孔中，每孔15.2μl，再分别向42个孔中加入3.8μl样品dna溶液(20-40ng/μl)，ntc对照加入pcr级无菌水代替模板dna，至此，得到42组“酶-样品混合板”；
10、s1:通过smartchip mydesign高通量加样平台分别将384孔“酶-引物混合板”和“酶-样品混合板”内的反应液加到smartchip芯片的5040个反应孔内，最终芯片上每个反应孔内的反应体系为100nl，包含1×sybr green i master mix，0.5μm正向引物，0.5μm反向引物，2-4ng/μl样品dna(均为终浓度)和无核酸酶灭菌水。
11、本专利技术还公开了所述的定量pcr引物组合物以及所述的高通量定量pcr芯片在以下任一方面的应用：
12、p1)在制备同时检测抗生素耐药基因和异源物质降解基因相关插入元件的产品中的应用；
13、p2)在制备检测抗生素耐药基因相关插入元件的产品中的应用；
14、p3)在制备检测异源物质降解基因相关插入元件的产品中的应用；
15、p4)在制备检测特定家族或者特定种类插入元件的产品中的应用。
16、本专利技术针对183种与抗生素耐药基因及12种异源物质降解基因有关的插入元件共设计了119对目标引物。应用该引物集于高通量定量pcr(ht-qpcr)平台可实现在相同扩增条件下一次性进行5040个定量pcr的插入元件检测，检测效率得到提高，同时具有特异性好，灵敏度高，可重复性强的优点。降低检测成本，可成功应用于环境样品中的插入元件的定量检测研究。
17、本专利技术对多种插入元件进行了适用于荧光定量pcr的特异性引物设计，且能利用极少的环境样品dna即可对上百种插入元件同时定量，与传统的单一基因定量以及高成本且数据繁冗的宏基因组测序分析比较，一是具有特异性，二是通量高，所需样品dna量少，总成本低。
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1.一种可检测多种插入元件的定量PCR引物组合物，其特征在于，所述的引物组合物包括：
2.根据权利要求1所述的可检测多种插入元件的定量PCR引物组合物，其特征在于，所述的第一引物组合物用于检测抗生素耐药基因相关插入元件；所述的第二引物组合物用于检测异源物质降解基因相关插入元件；所述的第三引物组合物能够用于同时检测抗生素耐药基因和异源物质降解基因相关插入元件。
3.一种可检测多种插入元件的高通量实时荧光定量PCR芯片，其特征在于，所述的荧光定量PCR芯片包括有权利要求1或2所述的定量PCR引物组合物。
4.如权利要求3所述的高通量实时荧光定量PCR芯片，其特征在于，还包括有样品DNA和无核酸酶灭菌水。
5.一种权利要求3或4所述的定量PCR芯片的制备方法，其特征在于，步骤如下：
6.权利要求1所述的定量PCR引物组合物以及权利要求3-4任一项所述的高通量定量PCR芯片在以下任一方面的应用：
【技术特征摘要】
1.一种可检测多种插入元件的定量pcr引物组合物，其特征在于，所述的引物组合物包括：
2.根据权利要求1所述的可检测多种插入元件的定量pcr引物组合物，其特征在于，所述的第一引物组合物用于检测抗生素耐药基因相关插入元件；所述的第二引物组合物用于检测异源物质降解基因相关插入元件；所述的第三引物组合物能够用于同时检测抗生素耐药基因和异源物质降解基因相关插入元件。
3.一种可检测多种插入元件的高通量实时荧光定...
【专利技术属性】
技术研发人员：苏建强，钟文婧，周艳艳，安新丽，黄福义，李虎，黄栩，杨小茹，朱永官，
申请(专利权)人：中国科学院城市环境研究所，
类型：发明
国别省市：
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