【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种基于gal4/uas系统的肝脏特异性胰岛素样生长因子结合蛋白7基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法及应用。
技术介绍
1、胰岛素样生长因子结合蛋白7(insulin-like growthfactorbindingprotein7，igfbp7)属于胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-likegrowthfactorbindingproteins，igfbps)家族成员。igfbps是一组同源蛋白质，属于胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor，igf)轴中重要成员，igf轴由配体(igf-ⅰ，ⅱ)、受体(igf-ⅰr，ⅱr)、结合蛋白(igfbps)和结合蛋白水解酶组成。作为igf轴中的结合蛋白，igfbps分为两个亚群：igf高亲和力igfbps亚群(igfbp1-6)和以igfbp7为代表的igf低亲和力亚群(igfbp7-15)。igfbp7与igf结合能力低，而与胰岛素的结合能力强，可引起胰岛素抵抗，研究发现，igfbp7与以胰岛素抵抗明显相关的非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fattyliverdisease，nafld)的发生发展密切相关。igfbp7也被发现通过调控肝星状细胞的活化促进肝脏组织纤维化的发生。此外，igfbp7在肿瘤中的研究受到广泛关注，大部分研究显示它是一个潜在的肿瘤抑制基因，如在肝癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、黑色素瘤等，但也有研究报道发现igfbp7在胰腺癌、食管鳞癌中呈现高表达，提示igfbp7通过不同信号通路影响
2、gal4/uas双元系统是果蝇遗传学中常用的转基因表达技术，我们尝试利用该技术在斑马鱼体内实现对外源基因的特异性表达调控。目前疾病研究中常用的基因过表达方式是将携带目的基因和其特异性启动子或增强子的克隆质粒转座成杆状病毒基因组直接转染到哺乳动物体外细胞，或通过腺病毒、慢病毒或其他方式介导的携带目的基因的质粒在动物体内组织中转染的方式。相比现在疾病研究中常用的基因过表达方式，利用双元表达系统gal4/uas在斑马鱼构建目的基因特定组织过量表达转基因品系，可在胚胎刚出生时直接编辑基因组转录表达系统，并通过传代和荧光筛选获得目的基因在特定组织的稳定过表达，这种过表达系统具有持续性、永久性和稳定性，并且对动物生长和发育没有外源性损伤，是研究特定基因过量表达对疾病影响的理想方式。
3、斑马鱼是一种小型脊椎类模式生物，属于热带淡水鱼。拥有与人类相似的系统和组织器官，基因和信号通路与人类高度保守，保守性可达85％。其生理、发育、代谢与哺乳动物高度相似，已被美国国立卫生研究院列为继小鼠和大鼠之后的第三大脊椎模式生物。与小鼠和大鼠相比，它作为模式动物具备更多优越性：个体小(目前唯一适用于微孔板高通量药物筛选的脊椎类动物)、发育周期短(24小时器官便开始形成，72-96小时器官发育完全)、实验周期短(筛选结果可在一周内得出)、费用低(约为鼠类的1/100-1/10)、体外受精、胚胎透明(可直接观察药物对内部器官的作用)、单次产卵数较高(150-200枚)以及实验用药量小(约为小鼠用量的1/100-1/1000)等。因此，斑马鱼已被用于发育生物学、基因功能研究、疾病发病机制研究等。目前已有多种斑马鱼疾病(如血液病、免疫系统疾病、脂肪性肝病等)模型建立成功，利用斑马鱼的疾病模型来研究治疗人类相关疾病是近年全球研究的热点项目。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种基于gal4/uas系统的肝脏特异性胰岛素样生长因子结合蛋白7基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法及应用。
2、为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供的技术方案是：一种基于gal4/uas系统的肝脏特异性胰岛素样生长因子结合蛋白7基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法，包括如下步骤：
3、步骤1：斑马鱼igfbp7基因序列如seq id no.01所示；
4、步骤2：利用tol2kit系统提供的中介构建体和gibson assembly技术构建转基因目标载体pdesttol2-4xuas-igfbp7-p2a-mcherry-crystallin-venus和载体pdesttol2-lfabp10-gal4-cmcl2-venus；
5、步骤3：利用tol2转座方法，将步骤2得到的2个载体分别与tol2 mrna导入单细胞期的斑马鱼胚胎中，荧光筛选稳定遗传的后代，获得2种稳定遗传转基因品系斑马鱼；
6、步骤4：将成年的2种稳定转基因品系斑马鱼交配，荧光筛选稳定遗传的眼睛和心脏同时表达绿色荧光的后代，即获得可稳定遗传的肝脏特异性过量表达igfbp7转基因斑马鱼。
7、优选的技术方案为：步骤2中，通过gibson assembly技术构建转基因目标载体pdesttol2-4xuas-igfbp7-p2a-mcherry-crystallin-venus，包括：
8、以斑马鱼cdna和pdesttol2-4xuas-gpr161-p2a-mcherry-crystallin-venus载体为模板，通过pcr分别获得斑马鱼igfbp7基因全长以及载体pdesttol2-4xuas-p2a-mcherry-crystallin-venus全长，引物序列分别为：
9、igfbp7f:atgctgtgtgttctcgtcctc；
10、flag-igfbp7r:tcgtctttgtagtcctcgagcagctcgctgtccttcaccatct；
11、pdestflagnewf:ctcgaggactacaaagacgacgac；
12、pdestuasr:catggtggctggatcctgcagac；
13、pcr产物经回收后，按照gibson组装试剂盒说明要求进行gibson组装连接，连接产物经大肠杆菌转化，制备质粒，测序验证获得正确的转基因目标载体pdesttol2-4xuas-igfbp7-p2a-mcherry-crystallin-venus。
14、优选的技术方案为：步骤2中，通过gibson assembly技术构建转基因目标载体pdesttol2-lfabp10-gal4-cmcl2-venus，包括：
15、step1：以载体pdesttol2cg和pdesttol2-4xuas-igfbp7-p2a-mcherry-crystallin-venus为模板，通过pcr获得斑马鱼心脏特异性启动子cmcl2基因全长和载体pdesttol2-venus全长，引物序列分别为：
16、clcm2pf:cgttttacggtacc本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于Gal4/UAS系统的肝脏特异性胰岛素样生长因子结合蛋白7基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于Gal4/UAS系统的肝脏特异性胰岛素样生长因子结合蛋白7基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法，其特征在于：步骤2中，通过Gibson assembly技术构建转基因目标载体pDestTol2-4XUAS-igfbp7-P2A-mCherry-crystallin-venus，包括：
3.根据权利要求1所述的基于Gal4/UAS系统的肝脏特异性胰岛素样生长因子结合蛋白7基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法，其特征在于：步骤2中，通过Gibson assembly技术构建转基因目标载体pDestTol2-lfabp10-Gal4- cmcl2-venus，包括：
4.根据权利要求1所述的基于Gal4/UAS系统的肝脏特异性胰岛素样生长因子结合蛋白7基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法，其特征在于：步骤3中，荧光筛选稳定遗传的后代包括：
5.根据权利要求4所述的基于Gal4/UAS系
6.权利要求1-5任一所述的可稳定遗传的肝脏特异性过量表达Igfbp7转基因斑马鱼在靶向IGFBP7基因防治肝癌发生发展的机制研究中的应用。
7.权利要求1-5任一所述的可稳定遗传的肝脏特异性过量表达Igfbp7转基因斑马鱼在靶向IGFBP7基因防治非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化发生发展的机制研究中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基于gal4/uas系统的肝脏特异性胰岛素样生长因子结合蛋白7基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于gal4/uas系统的肝脏特异性胰岛素样生长因子结合蛋白7基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法，其特征在于：步骤2中，通过gibson assembly技术构建转基因目标载体pdesttol2-4xuas-igfbp7-p2a-mcherry-crystallin-venus，包括：
3.根据权利要求1所述的基于gal4/uas系统的肝脏特异性胰岛素样生长因子结合蛋白7基因过量表达转基因斑马鱼的构建方法，其特征在于：步骤2中，通过gibson assembly技术构建转基因目标载体pdesttol2-lfabp10-gal4- cmcl2-venus，包括：
4.根据权利要求1所述的基于gal4/uas系统的肝脏特异性胰岛素样生长因子结合蛋白...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘立新，王燕琴，赵仲华，张瑞昕，
申请(专利权)人：山西医科大学，
类型：发明
国别省市：
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