【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一条地黄环烯醚萜氧化酶基因rgio及其应用，属于分子生物学。
技术介绍
1、环烯醚萜是由2个异戊二烯单位构成的单萜，具有典型的二元环、烯键和醚键结构，为蚁臭二醛的缩醛衍生物，其代表化合物有梓醇、桃叶珊瑚苷、马钱苷酸、栀子苷等。其中，梓醇是从地黄中分离出的一种环烯醚萜苷类成分，具有抗癌、神经保护、抗脑损伤、抗炎、降血糖等活性，被认为是治疗神经系统疾病的潜在先导化合物。
2、地黄(rehmannia glutinosa libosch.)是列当科地黄属多年生草本植物，以块根入药，其药用历史非常悠久，始载于《神农本草经》，被列为上品。在地黄中已经分离出86种环烯醚萜类化合物，其中梓醇是地黄中含量最丰富的一种环烯醚萜苷类成分。从《中华人民共和国药典》2015版到目前的2020版，梓醇一直作为地黄药材质量控制的指标性成分。
3、地黄的块根、叶和花均含有丰富的梓醇，叶中的梓醇含量略高于块根。鲜地黄中梓醇的含量最高，约为3％～5％，其次为生地黄(约为2％～3％)，熟地黄中的梓醇含量最低(仅0.2％左右)。地黄品种、产地以及采收时期的不同均会导致块根中梓醇含量的差异，影响地黄药材品质的稳定性。迄今，梓醇在植物中的生物合成途径还未完全解析。研究表明，梓醇由mva途径和mep途径产生的前体物异戊烯焦磷酸(ipp)和二甲基烯丙基焦磷酸脂(dmapp)，经一系列的催化磷酸化形成萜类骨架，继而经过多步反应合成的。
4、环烯醚萜氧化酶(iridoid oxidase，io)是植物环烯醚萜类化合物生物合成途径
5、因此，从地黄中克隆环烯醚萜氧化酶rgio基因，分析其表达特性和亚细胞定位，并利用瞬时表达揭示其分子功能，不但有助于揭示环烯醚萜类成分生物合成的分子机制，也为利用分子手段对环烯醚萜类成分的合成进行调控提供了重要的靶基因。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供一条地黄环烯醚萜氧化酶基因rgio，首次从地黄中克隆得到一条梓醇合成途径中的环烯醚萜氧化酶基因rgio序列，推测并获得其编码的氨基酸序列。在地黄叶中瞬时表达rgio可显著增加地黄叶片中的梓醇含量，从而确定其参与梓醇的生物合成。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
3、一条地黄环烯醚萜氧化酶基因rgio，基因rgio的核苷酸序列如seq id no:1所示；
4、或者如seq id no:1所示的核苷酸序列经取代和/或缺失、和/或添加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列。
5、所述的地黄环烯醚萜氧化酶基因rgio编码的氨基酸序列如seq id no:2所示；
6、或者如seq id no:2所示的氨基酸序列经取代和/或缺失、和/或添加一个或多个氨基酸残基且功能相同的衍生蛋白。
7、一种用于扩增地黄环烯醚萜氧化酶基因rgio的特异性引物，引物序列如seq idno:3和seq id no:4所示。
8、一种含有地黄环烯醚萜氧化酶基因rgio的重组载体。
9、一种含有地黄环烯醚萜氧化酶基因rgio的重组载体的重组菌株。
10、所述的地黄环烯醚萜氧化酶基因rgio在地黄叶片中瞬时过量表达中的应用。
11、所述的地黄环烯醚萜氧化酶基因rgio在调控植物梓醇合成中的应用。
12、所述的地黄环烯醚萜氧化酶基因rgio在调控地黄梓醇合成中的应用。
13、所述的地黄环烯醚萜氧化酶基因rgio在调控植物环烯醚萜类成分合成中的应用。
14、所述的地黄环烯醚萜氧化酶基因rgio在调控地黄环烯醚萜类成分合成中的应用。
15、本专利技术的有益效果：
16、本专利技术首次从地黄中克隆到rgio基因，通过对地黄叶片和块根进行转录组测序，筛选到一条与长春花crio同源性较高的序列，转录本长度为1909bp。地黄rgio基因的编码序列(cds)序列长度为1536bp，该基因编码511个氨基酸，蛋白质的分子量推测为58258.01da，等电点是9.34。实时荧光定量pcr分析表明，该基因在地黄叶片中有较高的表达量，且在meja的处理下表达量会增加。亚细胞定位表明rgio分布在内质网中。
17、本专利技术在植物双元表达载体中插入得到rgio基因，以花椰菜病毒(camv)35s为启动子表达驱动。将构建好的表达载体转入到根癌农杆菌gv3101中，将携带表达载体的农杆菌注射侵染地黄叶片，测定地黄叶片中梓醇的含量。结果显示，瞬时过量表达rgio基因后的地黄叶片中梓醇含量显著增加，rgio的表达量大幅度提高，说明地黄rgio的瞬时过量表达能促进地黄梓醇的合成，可以预测该基因在地黄分子育种方面具有很好应用前景。
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1.一条地黄环烯醚萜氧化酶基因RgIO，其特征在于，基因RgIO的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示；
2.如权利要求1所述的地黄环烯醚萜氧化酶基因RgIO，其特征在于，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
3.一种用于扩增如权利要求1地黄环烯醚萜氧化酶基因RgIO的特异性引物，其特征在于，引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
4.一种含有如权利要求1所述的地黄环烯醚萜氧化酶基因RgIO的重组载体。
5.一种含有如权利要求4所述的地黄环烯醚萜氧化酶基因RgIO的重组载体的重组菌株。
6.如权利要求1或2所述的地黄环烯醚萜氧化酶基因RgIO在地黄叶片中瞬时过量表达中的应用。
7.如权利要求1或2所述的地黄环烯醚萜氧化酶基因RgIO在调控植物梓醇合成中的应用。
8.如权利要求1或2所述的地黄环烯醚萜氧化酶基因RgIO在调控地黄梓醇合成中的应用。
9.如权利要求1或2所述的地黄环烯醚萜氧化酶基因RgIO在调控植物环烯醚萜类成分合成中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一条地黄环烯醚萜氧化酶基因rgio，其特征在于，基因rgio的核苷酸序列如seq idno:1所示；
2.如权利要求1所述的地黄环烯醚萜氧化酶基因rgio，其特征在于，该基因编码的氨基酸序列如seq id no:2所示；
3.一种用于扩增如权利要求1地黄环烯醚萜氧化酶基因rgio的特异性引物，其特征在于，引物序列如seq id no:3和seq id no:4所示。
4.一种含有如权利要求1所述的地黄环烯醚萜氧化酶基因rgio的重组载体。
5.一种含有如权利要求4所述的地黄环烯醚萜氧化酶基因...
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