【技术实现步骤摘要】
本申请属于基因工程，尤其涉及一种细菌表面展示载体及其制备方法和应用。
技术介绍
1、细菌表面展示技术是指将编码特定锚定蛋白和功能性外源蛋白的基因序列整合到一起并转入特定细菌，利用锚定蛋白将功能性外源蛋白以表面展示在细菌细胞表面。与胞内表达蛋白相比，一方面其表达的蛋白是展示在细菌细胞表面，比游离的蛋白质更稳定。而且表面展示有利于蛋白质的折叠、溶解和活性与稳定性的维持，特别是易于聚集和降解的蛋白质可以实现从拥挤的细胞质到宽敞的培养基的快速转移，避免包涵体的形成。其次，表面展示的蛋白，可以自由接触与其相互作用的蛋白或分子，而无需底物跨越膜屏障。
2、将自转运蛋白ag43用于表面展示具有多种优势：(1)利用ag43展示外源蛋白具有高效性。研究表明，在一个大肠杆菌中就可以表达50,000个ag43分子。(2)ag43可以在多种革兰氏阴性菌宿主中进行表达，可以在多个宿主菌中实现外源蛋白的表达。(3)可以展示较大蛋白质，可将近500个氨基酸的外源蛋白表达于细菌细胞表面，而其它锚定蛋白如细菌菌毛只能插入20-30个外源蛋白氨基酸。(4)ag43主要与细菌聚集以及生物膜形成有关，具有低毒甚至无毒的特点。因此，基于自转运蛋白ag43构建的细菌表面展示系统是展示外源蛋白的理想系统，可广泛应用于全细胞催化、蛋白质或肽文库筛选、生物修复以及疫苗研发等多个领域。
技术实现思路
1、本申请的目的在于提供一种通用型的细菌表面展示载体及其制备方法和应用，所述细菌表面展示载体能够实现外源蛋白在细菌细胞表面
2、为了实现上述专利技术目的，本申请提供以下技术方案：
3、一方面，本申请提供了一种细菌表面展示载体，包括初始载体、周质分泌信号肽、ag43的β-桶状结构蛋白的编码基因；
4、所述周质分泌信号肽包括ag43信号肽、pelb信号肽、phoa信号肽、phoe信号肽、ompa信号肽、ompc信号肽、ompf信号肽、ompt信号肽、dsba信号肽中的至少一种。
5、可选地，所述初始载体带有t7启动子；
6、所述t7启动子的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7、可选地，所述初始载体包括pet22b。
8、可选地，所述ag43的β-桶状结构蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
9、可选地，所述ag43的β-桶状结构蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。
10、可选地，所述ag43信号肽的氨基酸序列如seq id no.4所示。
11、可选地，所述pelb信号肽的氨基酸序列如seq id no.5所示。
12、可选地，所述phoa信号肽的氨基酸序列如seq id no.6所示。
13、可选地，所述phoe信号肽的氨基酸序列如seq id no.7所示。
14、可选地，所述ompa信号肽的氨基酸序列如seq id no.8所示。
15、可选地，所述ompc信号肽的氨基酸序列如seq id no.9所示。
16、可选地，所述ompf信号肽的氨基酸序列如seq id no.10所示。
17、可选地，所述ompt信号肽的氨基酸序列如seq id no.11所示。
18、可选地，所述dsba信号肽的氨基酸序列如seq id no.12所示。
19、第二方面，本申请提供了上述细菌表面展示载体的制备方法，包括如下步骤：
20、(1)采用ndeⅰ和ecorⅰ对初始载体进行双酶切，将酶切后的初始载体与周质分泌信号肽连接，得到初始载体-信号肽；
21、(2)采用salⅰ和xhoⅰ对所述初始载体-信号肽进行双酶切，将酶切后的初始载体-信号肽与ag43的β-桶状结构蛋白的编码基因pcr回收产物连接，得到所述细菌表面展示载体。
22、第三方面，本申请提供了上述细菌表面展示载体在实现细菌表面展示外源蛋白和/或生产外源蛋白中的应用。
23、可选地，所述外源蛋白包括新冠病毒表面蛋白受体结构域、绿色荧光蛋白、绿色荧光蛋白纳米抗体、β-葡萄糖苷酶、人乳头瘤病毒16型l1蛋白中的至少一种。
24、第四方面，本申请提供了一种在细菌表面展示外源蛋白的方法，包括如下步骤：
25、s1、将外源蛋白的编码基因与上述的细菌表面展示载体连接，得到重组蛋白表达载体；
26、s2、将所述重组蛋白表达载体转化至出发菌株的感受态细胞，得到重组菌；
27、s3、将所述重组菌接种至培养基中，依次进行培养和诱导表达，即可。
28、可选地，步骤s1包括：将外源蛋白的编码基因插入上述的细菌表面展示载体的ecorⅰ和salⅰ多克隆位点处，得到重组蛋白表达载体。
29、可选地，步骤s1中，所述外源蛋白包括新冠病毒表面蛋白受体结构域、绿色荧光蛋白、绿色荧光蛋白纳米抗体、β-葡萄糖苷酶、人乳头瘤病毒16型l1蛋白中的至少一种。
30、可选地，新冠病毒表面蛋白受体结构域的编码基因的核苷酸序列如seq id no.13所示。
31、可选地，绿色荧光蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no.14所示。
32、可选地，绿色荧光蛋白纳米抗体的编码基因的核苷酸序列如seq idno.15所示。
33、可选地，β-葡萄糖苷酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no.16所示。
34、可选地，人乳头瘤病毒16型l1蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no.17所示。
35、可选地，步骤s2中，所述出发菌株包括大肠杆菌。
36、可选地，步骤s3中，所述培养基为lb培养基。
37、可选地，所述lb培养基含有80～120mg/l的氨苄抗生素。
38、可选地，所述lb培养基含有80mg/l、90mg/l、100mg/l、110mg/l或120mg/l的氨苄抗生素。
39、可选地，步骤s3中，所述培养为震荡培养。
40、可选地，所述震荡培养的温度为35～38℃；
41、所述震荡培养的转速为200～250rpm；
42、所述震荡培养为培养至菌液od580的值为0.8～1.2。
43、可选地，所述震荡培养的温度独立地选自35℃、36℃、37℃、38℃中的任意值或任意两者之间的范围值。
44、可选地，所述震荡培养的转速独立地选自200rpm、210rpm、220rpm、230rpm、240rpm、250rpm中的任意值或任意两者之间的范围值。
45、可选地，所述震荡培养为培养至菌液od580的值为0.8、0.9、1.0、1.1或1.2。
46、可选地，步骤s3中，所述诱导表达采用iptg进行。
47、可选地，所述iptg的摩尔浓度为0.1～0.3m本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种细菌表面展示载体，其特征在于，包括初始载体、周质分泌信号肽、Ag43的β-桶状结构蛋白的编码基因；
2.根据权利要求1所述的一种细菌表面展示载体，其特征在于，所述初始载体带有T7启动子；
3.根据权利要求1所述的一种细菌表面展示载体，其特征在于，所述Ag43信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；
4.权利要求1～3任意一项所述的细菌表面展示载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.权利要求1～3任意一项所述的细菌表面展示载体在实现细菌表面展示外源蛋白和/或生产外源蛋白中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述外源蛋白包括新冠病毒表面蛋白受体结构域、绿色荧光蛋白、绿色荧光蛋白纳米抗体、β-葡萄糖苷酶、人乳头瘤病毒16型L1蛋白中的至少一种。
7.一种在细菌表面展示外源蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S1包括：将外源蛋白的编码基因插入权利要求1～3任意一项所述的细菌表面展示载体的EcoRⅠ和SalⅠ多克隆位点
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述外源蛋白包括新冠病毒表面蛋白受体结构域、绿色荧光蛋白、绿色荧光蛋白纳米抗体、β-葡萄糖苷酶、人乳头瘤病毒16型L1蛋白中的至少一种；
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述出发菌株包括大肠杆菌；
...【技术特征摘要】
1.一种细菌表面展示载体，其特征在于，包括初始载体、周质分泌信号肽、ag43的β-桶状结构蛋白的编码基因；
2.根据权利要求1所述的一种细菌表面展示载体，其特征在于，所述初始载体带有t7启动子；
3.根据权利要求1所述的一种细菌表面展示载体，其特征在于，所述ag43信号肽的氨基酸序列如seq id no.4所示；
4.权利要求1～3任意一项所述的细菌表面展示载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.权利要求1～3任意一项所述的细菌表面展示载体在实现细菌表面展示外源蛋白和/或生产外源蛋白中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述外源蛋白包括新冠病毒表面蛋白受体结构域、绿色荧...
【专利技术属性】
技术研发人员：范恩国，秦有才，张续严，蔡锟，储引娣，
申请(专利权)人：中国医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。