【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种改造β-酮硫解酶提高其对丁二酰-coa特异性的方法及其在己二酸合成中的应用，属于生物工程领域。
技术介绍
1、己二酸是一种重要的二元羧酸化合物，当前己二酸最重要的应用领域是合成尼龙类纤维(比如尼龙6,6)。预计到2020年，己二酸全球的市场价值将达到75亿美元。工业上己二酸的生产路线主要通过硝酸对环己醇—环己酮的混合物(醇酮油，也称ka油)进行氧化制取。但是该方法具有工艺流程长、副产物多、产品收率低、工业“三废”排放严重等问题，特别是温室气体的排放量十分大。因此，人们迫切需要寻找一种能替代传统化学合成己二酸的方法。随着生物技术的发展，全生物合成法生产有机酸具有生产成本低，生产工艺简单，污染小，产品纯度高等优势，所以该方法越来越受人们青睐。近年来，许多国内外的研究机构投入了大量的资源对上述方法进行了深入的研究。
2、cheong seokjung研究团队发现了与3-氧代己二酰辅酶a途径类似的途径，然后将不同来源的5种酶的基因，连接到质粒后导入大肠杆菌进行表达，从而获得己二酸的积累，包括：paaj(β-酮硫解酶，3-ketoacyl-coa thiolase)，paah(3-羟酰基-coa脱氢酶，3-hydroxyacyl-coa dehydrogenase)，paaf(3-羟基己二酰脱氢酶，3-hydroxyadipyl-coadehydrogenase)，tdter(5-羧基-2-戊烯酰辅酶a还原酶，5-carboxy-2-pentenoyl-coareductase)，cat 1(酰基辅酶a转移酶
技术实现思路
1、为解决上述问题，提供了改进了氨基酸序列的β-酮硫解酶突变体及其在己二酸生产中的应用。
2、本专利技术提供了一种提高β-酮硫解酶催化丁二酰-coa催化能力的方法，所述方法是在β-酮硫解酶tfu_0875亲本的基础上，将第163位的亮氨酸突变为组氨酸，第217位的谷氨酸突变为亮氨酸，和/或第249位的天冬酰胺突变为色氨酸。
3、在一种实施方式中，所述β-酮硫解酶tfu_0875亲本具有seq id no.10所示的氨基酸序列。
4、本专利技术还提供了一种提高己二酸合成能力的方法，所述方法是在重组细胞中表达β-酮硫解酶突变体；所述β-酮硫解酶突变体是在seq id no.10所示的β-酮硫解酶的基础上，将第163位的亮氨酸突变为组氨酸，并将第217位的谷氨酸突变为亮氨酸，并将第249位的天冬酰胺突变为色氨酸。
5、在一种实施方式中，所述重组细胞以质粒prsf为表达载体，表达所述β-酮硫解酶突变体、3-羟基-己二酰辅酶a脱氢酶、己二酰-辅酶a转移酶、3-羟酰基-辅酶a脱氢酶、5-羧基-2-戊烯酰辅酶a还原酶和、酰基辅酶a转移酶。
6、在一种实施方式中，所述重组细胞以质粒prsf为表达载体，表达上β-酮硫解酶突变体基因、3-羟基-己二酰辅酶a脱氢酶的编码基因和己二酰-辅酶a转移酶的编码基因，并以pcdf为表达载体，表达、3-羟酰基-辅酶a脱氢酶的编码基因、5-羧基-2-戊烯酰辅酶a还原酶的编码基因和酰基辅酶a转移酶的编码基因。
7、在一种实施方式中，所述β-酮硫解酶突变体的序列如seq id no.7～9任一所示。
8、在一种实施方式中，所述3-羟基-己二酰辅酶a脱氢酶的基因序列如seq id no.3所示，所述己二酰-辅酶a转移酶的基因序列如seq id no.5所示；所述3-羟酰基-辅酶a脱氢酶的基因序列如seq id no.2所示；所述5-羧基-2-戊烯酰辅酶a还原酶的基因序列如seqid no.4所示；所述酰基辅酶a转移酶的基因序列如seq id no.6所示。
9、在一种实施方式中，所述重组细胞以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母或毕赤酵母为宿主。
10、本专利技术还提供了一种具有生产己二酸能力的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌以质粒prsf为表达载体，表达上β-酮硫解酶突变体基因、3-羟基-己二酰辅酶a脱氢酶的编码基因和己二酰-辅酶a转移酶的编码基因，并以pcdf为表达载体，表达、3-羟酰基-辅酶a脱氢酶的编码基因、5-羧基-2-戊烯酰辅酶a还原酶的编码基因和酰基辅酶a转移酶的编码基因。
11、在一种实施方式中，所述β-酮硫解酶突变体的序列如seq id no.7～9任一所示。
12、在一种实施方式中，所述3-羟基-己二酰辅酶a脱氢酶的基因序列如seq id no.3所示，所述己二酰-辅酶a转移酶的基因序列如seq id no.5所示；所述3-羟酰基-辅酶a脱氢酶的基因序列如seq id no.2所示；所述5-羧基-2-戊烯酰辅酶a还原酶的基因序列如seqid no.4所示；所述酰基辅酶a转移酶的基因序列如seq id no.6所示。
13、在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以e.coli k12 mg1655δ8(atob、sucd、pflb、arca、adhe、ldha、poxb和pta)为宿主。
14、在一种实施方式中，所述e.coli k12 mg1655δ8公开于论文《biosensor-basedhigh-throughput screening enabled efficient adipic acid production》中。
15、本专利技术还提供一种生产己二酸的方法，所述方法是将所述重组大肠杆菌在培养基中培养一段时间。
16、在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌在37℃，200-250r/min培养制备种子液，再将种子液以2％的接种量接入到mops发酵培养基中发酵生产己二酸。
17、有益效果：
18、本专利技术对产己二酸代谢途径3-氧代己二酰辅酶a途径中的初始步骤tfu_0875进行定点突变，得到一株己二酸产量提高的突变菌株。采用本专利技术的突变菌株发酵72h，己二酸产量由对照菌株的0.17g/l提高到0.23g/l，提高了近35％。采用本专利技术的突变体，提高了己二酸产量，降低生产成本，促进己二酸在工业上的推广应用。
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1.一种提高β-酮硫解酶催化丁二酰-CoA催化能力的方法，其特征在于，在β-酮硫解酶Tfu_0875亲本的基础上，将第163位的亮氨酸突变为组氨酸，第217位的谷氨酸突变为亮氨酸，和/或第249位的天冬酰胺突变为色氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述β-酮硫解酶Tfu_0875亲本具有SEQ IDNO.10所示的氨基酸序列。
3.一种提高己二酸合成能力的方法，其特征在于，在重组细胞中表达β-酮硫解酶突变体；所述β-酮硫解酶突变体的序列如SEQ ID NO.7～9任一所示。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组细胞以质粒pRSF为表达载体，表达所述β-酮硫解酶突变体、3-羟基-己二酰辅酶A脱氢酶、己二酰-辅酶A转移酶、3-羟酰基-辅酶A脱氢酶、5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶和酰基辅酶A转移酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述重组细胞以质粒pRSF为表达载体，表达上β-酮硫解酶突变体基因、3-羟基-己二酰辅酶A脱氢酶的编码基因和己二酰-辅酶A转移酶的编码基因，并以pCDF为表达载体，表达
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述β-酮硫解酶突变体是在SEQ ID NO.10所示的β-酮硫解酶的基础上，将第163位的亮氨酸突变为组氨酸，并将第217位的谷氨酸突变为亮氨酸，并将第249位的天冬酰胺突变为色氨酸。
7.一种具有生产己二酸能力的重组大肠杆菌，其特征在于，以质粒pRSF为表达载体，表达如SEQ ID NO.7～9任一所示的β-酮硫解酶突变体、3-羟基-己二酰辅酶A脱氢酶的编码基因和己二酰-辅酶A转移酶的编码基因；并以pCDF为表达载体，表达、3-羟酰基-辅酶A脱氢酶的编码基因、5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶的编码基因和酰基辅酶A转移酶的编码基因。
8.根据权利要求7所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述3-羟基-己二酰辅酶A脱氢酶的基因序列如SEQ ID NO.3所示，所述己二酰-辅酶A转移酶的基因序列如SEQ ID NO.5所示；所述3-羟酰基-辅酶A脱氢酶的基因序列如SEQ ID NO.2所示；所述5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶的基因序列如SEQ ID NO.4所示；所述酰基辅酶A转移酶的基因序列如SEQ IDNO.6所示。
9.一种生产己二酸的方法，其特征在于，将权利要求7或8所述的重组大肠杆菌在培养基中培养一段时间。
10.权利要求7～8任一所述的重组大肠杆菌，或权利要求8～9任一所述方法在生产含己二酸的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种提高β-酮硫解酶催化丁二酰-coa催化能力的方法，其特征在于，在β-酮硫解酶tfu_0875亲本的基础上，将第163位的亮氨酸突变为组氨酸，第217位的谷氨酸突变为亮氨酸，和/或第249位的天冬酰胺突变为色氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述β-酮硫解酶tfu_0875亲本具有seq idno.10所示的氨基酸序列。
3.一种提高己二酸合成能力的方法，其特征在于，在重组细胞中表达β-酮硫解酶突变体；所述β-酮硫解酶突变体的序列如seq id no.7～9任一所示。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组细胞以质粒prsf为表达载体，表达所述β-酮硫解酶突变体、3-羟基-己二酰辅酶a脱氢酶、己二酰-辅酶a转移酶、3-羟酰基-辅酶a脱氢酶、5-羧基-2-戊烯酰辅酶a还原酶和酰基辅酶a转移酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述重组细胞以质粒prsf为表达载体，表达上β-酮硫解酶突变体基因、3-羟基-己二酰辅酶a脱氢酶的编码基因和己二酰-辅酶a转移酶的编码基因，并以pcdf为表达载体，表达、3-羟酰基-辅酶a脱氢酶的编码基因、5-羧基-2-戊烯酰辅酶a还原酶的编码基因和酰基辅酶a转移酶的编码基因。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述β-酮...
【专利技术属性】
技术研发人员：邓禹，周胜虎，刘丽霞，毛银，赵运英，李国辉，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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