鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术属于兽用生物制品技术领域，更具体是涉及一种鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗及其制备方法。具体是用免疫原性良好的鸭疫里默氏杆菌Ｉ型、ＩＩ型及大肠埃希氏菌Ｏ７８型接种于适宜培养基培养，经甲醛溶液灭活后，与油佐剂乳化制成。用于预防鸭的传染性浆膜炎和大肠埃希氏菌病。本发明专利技术的疫苗的制备方法操作简单，制备出的疫苗性能稳定，能有效的预防鸭传染性浆膜炎和鸭大肠杆菌病两种疾病。

Riemerella anatipestifer, Escherichia coli two inactivated vaccine and preparation method thereof

The invention belongs to the field of veterinary biological products, in particular to a kind of Riemerella anatipestifer and Escherichia coli two combined inactivated vaccine and preparation method thereof. In particular with good immunogenicity of Riemerella anatipestifer I type, II type and O78 type Escherichia coli were inoculated in the culture medium for culture, inactivated by Formaldehyde Solution, made with oil emulsion adjuvant. It is used to prevent infectious dermatitis and Escherichia coli in ducks. The preparation method of the vaccine of the invention is simple to operate, and the prepared vaccine has stable performance and can effectively prevent two kinds of diseases of infectious infectious disease of ducks and colibacillosis of ducks.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于兽用生物制品
，更具体是涉及一种。
技术介绍
鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里氏杆菌(Riemerellaanatipestifer， RA)引起的急性或慢 性接触性、败血性传染病。鸭大肠埃希氏菌病(Escherchia coli)是由致病性大肠杆菌引起 的出血性、渗出性和败血性的传染病。不同品种、天龄及性别的鸭群均可感染发病，而 且这两种病通常混合并发感染。鸭发生传染性浆膜炎后，往往继发鸭大肠埃希氏菌病， 导致鸭群大批死亡，给养殖场造成严重的经济损失。 鸭传染性浆膜炎又称为鸭疫里默氏杆菌病是目前造成养鸭业经济损失的最主要 传染病之一，在全球范围内大多数有集约化养鸭生产的国家和地区均有本病发生，在我 国几乎所有养鸭区都有发生。本病的发病率在5% -100%，死亡率通常为5% -70%或更 高，鸭的易感天龄为10-30天。使用疫苗进行免疫接种是控制该病的有效措施，但鸭疫 里默氏菌血清型众多，到目前为止，共报道有21个血清型(1-21型)，各血清型之间又没 有交叉保护，这就要求使用疫苗的抗原血清型必须与生产中流行菌株的血清型一致。 鸭大肠杆菌病是由鸭埃希氏大肠杆菌引起的各种天龄鸭的急性败血性细菌病， 以心包炎、气囊炎、肝周炎、腹膜炎为主要特征，在鸭群中常与鸭疫里默氏杆菌病伴 发。鸭埃希氏大肠杆菌有08、 015、 019、 073、 078等多个血清型普遍存在。
技术实现思路
本专利技术提供一种可以有效预防鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌的二联灭活疫 苗的制备方法。 本专利技术的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法，包括如 下步骤 (l)种子液的制备，将鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏菌基础种子分别接种于相应 的培养基中进行培养，得到种子液； (2)制苗用菌液的制备，在相应的培养基中接入步骤(l)得到的种子液进行培养得 到； (3)灭活，将步骤(2)得到的制苗用菌液进行灭活； (4)疫苗的制备，在步骤(3)得到的灭活菌液中加入油佐剂等辅料，乳化分装，得 到疫苗成品。 优选地，所述鸭疫里默氏杆菌疫苗株为I型和II型。 优选地，所述大肠埃希氏菌为078型。 优选地，所述鸭疫里默氏杆菌的培养基为特制胰酶大豆培养基。特制胰酶大豆培养基的制备方法如下胰蛋白胨，10g;大豆蛋白胨，10g;酵母浸出干粉，5g ;葡萄糖，2g; NaCl， 5g;调节pH值为7.4士0.2，补足水份至1000mL，分装后于12rC高压灭 菌20min，置4t:冰箱备用，使用前加入适量的无菌鸭胚浸出液。制备TSA固体培养基 时，在其中另外加入琼脂粉15g，同样高压灭菌，冷却至适宜温度，加入适量的预先温育 的无菌鸭胚浸出液。无菌操作倒入灭菌平皿中，制成平板，室温凝固后，倒置4t:冰箱备 用。 优选地，所述大肠埃希氏菌的培养基为改良马丁肉汤培养基。改良马丁肉汤培 养基的制备方法如下改良马丁汤(pH7.4士0.2)，牛肉汤500ml，猪胃消化液500ml， NaC12.5g。上述成分混合后，以NaOH调节pH值为7.4±0.2，煮沸20-40分钟，补足水 份至1000ml，冷却沉淀，抽取上清液，经滤纸过滤，滤液应为澄清，淡黄色。按需要量 分装后，于116t:高压灭菌30min，置4保存备用，用前加入0.03-0.06%的无菌辅酶。 制备改良马丁固体培养基时，在其中另外加入琼脂粉15g，加热熔化后，分装到小试管 中，高压灭菌。或分装到三角瓶中高压灭菌后，冷却到适宜温度加入0.03-0.06%的无菌 辅酶并混匀后制备平皿，室温凝固并无菌检验合格后，置4t:保存备用。 为了更完善本专利技术的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌的二联灭活疫苗的制备 方法，在步骤(1)得到种子液后和步骤(2)得到制苗用菌液后都还包括检验提纯的步骤。 优选地，所述步骤(3)中是用甲醛溶液灭活菌液。 在本专利技术的一个优选实施例中，所述步骤(4)中制备出的疫苗为油乳剂灭活疫苗。 本专利技术还提供一种用上述制备方法制备而来的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆 菌二联灭活疫苗。 本专利技术的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗采用的种子菌是经过 血清学调查，严格筛选出来的。能有效预防鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌。本专利技术 的疫苗制备方法简单，产品效果稳定。而且鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活 疫苗单次注射，可以有效预防鸭传染性浆膜炎和鸭大肠杆菌病两种疾病的目的，省时省 事，预防效率高。 下面将详细介绍本专利技术的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗及其 制备方法。具体实施例方式本专利技术的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗采用的种子菌是经过 血清学调查，严格筛选出来的。鸭疫里默氏杆菌是通过细菌的分离纯化、RA16sRNA基 因的克隆、生化实验、动物试验以及血清学等一系列的实验共分离鉴定了 148株鸭疫里 默氏杆菌，其中RA1型菌SS株(占分离菌的37.84%)， RA2型菌M株(占分离菌的 21.62%)，其它血清型60株(占分离菌的40.54%)。 在分离的菌中RA1和RA2两个血 清型占有绝对的优势。在对已有的RA1型和RA2型菌株进行免疫原性检测，成功筛选出 免疫原性良好的I型和II型各一株鸭疫里默氏杆菌作为制备疫苗的候选株。对鸭疫里默 氏杆菌分离鉴定的同时，对大肠埃希氏菌也进行了分离鉴定，通过细菌的分离纯化、生 化实验、动物试验以及大肠埃希氏菌单因子血清的凝集实验等一系列的检测表明，成功分离鉴定了近百株大肠埃希氏菌，08、 015、 019、 073、 078等多个血清型都普遍存在，总 数占到分离菌的90%以上，其中078占到总数的35.7% (35/98)，试验结果表明078为主要 的血清型。在对35株大肠埃希氏菌078株进行的免疫原性试验后，成功筛选到一株大肠 埃希氏菌作为制备疫苗的候选株。 本专利技术的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗是用免疫原性良好的 鸭疫里默氏杆菌I型、11型及大肠埃希氏菌078型作为种子菌接种于适宜培养基培养，经 甲醛溶液灭活后，与油佐剂乳化制成。用于预防鸭的传染性浆膜炎和大肠埃希氏菌病。 制备实施例 1培养基 1.1鸭疫里默氏杆菌培养基 鸭疫里默氏杆菌采用特制胰酶大豆液体培养基培养。 1.2大肠埃希氏菌培养基 大肠埃希氏菌采用改良马丁肉汤培养。 2半成品的制备 2.1鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏菌 2丄1生产种子的制备 取出鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏菌基础种子各l瓶，划线接种于相应的培养 基上，37t:培养24小时，选取典型菌落5-10个混合于TSB肉汤中，接种鲜血斜面上，置 37t:培养24小时，保存于4t:冰箱，经检验纯粹后作为生产种子批。保存期不超过7d。 2丄2工作种子液的制备 将生产种子接种于适量的相应的培养基中，37t:振荡培养24小时，经检验纯粹 后作为工作种子液。置4t:保存不超过3d。 2丄3制苗用菌液制备 按培养基的量接入5% -10%的种子液37t:培养8-14小时。 2丄4纯粹检验及活菌计数 菌液培养完成后，取样用相同的培养基进行纯粹检验。按《中华人民共和国兽 药典》(2005年版)附录15进行，应纯粹。同时作活菌计数，按附录17进行。各菌活 菌数应不低于3X 10lclCFU/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：　　　　（１）种子液的制备，将鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏菌基础种子分别接种于相应的培养基中进行培养，得到种子液；　　　　（２）制苗用菌液的制备，在相应的培养基中接入步骤（１）得到的种子液进行培养得到；　　　　（３）灭活，将步骤（２）得到的制苗用菌液进行灭活；　　　　（４）疫苗的制备，在步骤（３）得到的灭活菌液中加入要用辅料，混合、分装，得到疫苗成品。

【技术特征摘要】
一种鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤(1)种子液的制备，将鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏菌基础种子分别接种于相应的培养基中进行培养，得到种子液；(2)制苗用菌液的制备，在相应的培养基中接入步骤(1)得到的种子液进行培养得到；(3)灭活，将步骤(2)得到的制苗用菌液进行灭活；(4)疫苗的制备，在步骤(3)得到的灭活菌液中加入要用辅料，混合、分装，得到疫苗成品。2. 如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法， 其特征在于，所述鸭疫里默氏杆菌分别为I型和II型。3. 如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法， 其特征在于，所述大肠埃希氏菌为078型。4. 如权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法， 其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：张毓金，齐冬梅，林旭野，巫月生，赖月辉，李嘉爱，蔡植松，
申请(专利权)人：广东永顺生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：81[]