本发明专利技术公开了表达脊椎动物β干扰素的ＣＨＯ细胞系，其含有编码所述动物β干扰素的基因。更具体地，本发明专利技术公开了表达鸡β干扰素的ＣＨＯ细胞系。本发明专利技术还涉及利用上述ＣＨＯ细胞系生产脊椎动物β干扰素标准品的方法以及通过该方法获得的鸡β干扰素，其具有极高的比活性和稳定性，可用作鸡β干扰素生物学活性检测时的标准品和用于鸡传染性疾病的预防和治疗，具有重要的应用前景和市场前景。
CHO cell line expressing chicken interferon beta and uses thereof
The present invention discloses a CHO cell line expressing vertebrate beta interferon, which contains a gene encoding the animal beta interferon. More specifically, the present invention discloses a CHO cell line expressing chicken interferon beta. The invention also relates to methods of using the CHO cell line producing vertebrate interferon beta standard and chicken beta interferon obtained by this method, which has a high specific activity and stability, can be used as a standard for detection of chicken interferon beta and biological activity for the prevention and treatment of infectious diseases, and has important application prospect and the market prospect.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及表达脊椎动物卩干扰素的CHO细胞系，其含有编码所述 动物(3干扰素的基因。更具体地，本专利技术公开了表达鸡(3干扰素的CHO 细胞系。本专利技术还涉及利用上述CHO细胞系生产鸡P干扰素标准品的方 法以及通过该方法获得的的鸡P干扰素，其具有极高的比活性和稳定性， 可用作鸡卩干扰素生物学活性检测时的标准品和用于鸡传染性疾病的预防 和治疗。
技术介绍
I型干扰素是脊椎动物天然免疫系统的重要组成部分，为现代医学的 重要研究领域。如今，病毒感染宿主时逃避干扰素等天然免疫的机制成为 研究热点[1-3]，这为病毒防治在理论上提供有力支持。鸡马立克氏病 (marek's disease virus ， MDV) [4'5]、鸡贫血病毒(Chicken anaemia virus ) [6]、传染性粘液囊病病毒(infectious bursal disease virus, IBDV ) [6'7]、新 城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV) [8'9]、禽流感病毒(Avian Influenza virus, AIV) [12]等病毒在感染宿主时，破坏I型干扰素系统都为它们突 破宿主免疫系统的一个重要的机制。I型干扰素在人的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B) [13'14]、慢性丙型 肝炎(chronic hepatitis C) [15]、多发性硬化症(multiple sclerosis) [16〗、月中瘤疾病[17'18]及其它疾病19'2()]的治疗中发挥了重要作用。鸡I型干扰素对 MDV則、NDV[22]、 AIV问等常见鸡病毒病的治疗具有良好的前景。目前， 国内的鸡I型干扰素的生产主要采用原核[24]和酵母表达系统[25]。因此，不管是I型干扰素相关的基础研究还是临床使用，都需要高活 性、天然的I型干扰素样品，此外还需要对其生物学活性进行准确、便捷 的定量。干扰素的定量需要稳定的标准品，目前农业部颁布的兽用生物制 品质量标准中的脊椎动物天然鸡白细胞干扰素是以鸡新城疫病毒诱导鸡白细胞获得的，制作工艺和产品成分复杂，最终产品的活性较低，约为10000 AU* mL—1。哺乳动物细胞表达的脊椎动物干扰素是与其它表达系统 相比能够正确折叠、糖基化和翻译后修饰，因此更稳定、比活性更高、更 适合作为标准品，而目前缺乏源于哺乳动物细胞的脊椎动物鸡的IFN-(3标 准品。综上，获得高水平哺乳动物细胞表达的脊椎动物鸡I型干扰素具有 重要的基础研究和应用研究意义。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是建立高效表达鸡IFN-P的CHO-K1细胞表达系统。 .具体地，本专利技术涉及如下各项1. 一种表达鸡(3干扰素的CHO细胞系(Chinese Hamster Ovary Cell, 中国仓鼠卵巢细胞)，其含有(或表达)编码鸡P干扰素的基因。2. 根据权利要求l所述的CHO细胞系，其中所述鸡|3干扰素的氨基 酸序列如SEQ ID NO: 2所示。3. 根据权利要求1所述的CHO细胞系，其中所述编码鸡p干扰素的 基因如SEQ ID NO: 1所示。4. 根据权利要求1-3任一项所述的CHO细胞系，其中在所述编码鸡(3 干扰素的基因之前加入了 Kozak序列。5. 根据权利要求1所述的CHO细胞系，其是保藏号为CGMCC No. 2414的CHO细胞系。6. —种生产鸡P干扰素标准品的方法，该方法包括1) 培养根据权利要求1至5中任何一项所述的CHO细胞系；2) 从所述的CHO细胞系的培养液中提取P干扰素，用作鸡P干扰素 的标准品。7. 根据权利要求6的方法，其中所述CHO细胞系是保藏号为CGMCC No. 2414的CHO细胞系。8. 根据权利要求6或7的方法生产的鸡p干扰素标准品。9. 一种试剂盒，其包含根据权利要求6或7的方法生产的鸡卩干扰素 标准品，该试剂盒可以用于鸡传染性疾病的预防和治疗或者用于鸡P干扰10.根据权利要求1至5中任何一项所述的CHO细胞系生产的鸡(3 干扰素在制备药物中的应用，所述药物用于鸡传染性疾病的预防和治疗。 所述疾病特别是禽流感病毒引起的疾病。更具体地，在本专利技术的一个实施方案中，把鸡P干扰素(ChIFN-p) 的ORF基因克隆至真核稳定表达载体pCI-neo (ChIFN-p在高效启动子 CMV控制下表达)，并稳定转染至CHO-K1细胞，经G418压力筛选和2 次单克隆，筛选出可稳定表达重组ChlFN-(3的CH0-K1细胞克隆 (CHO-ChIFN-P)。本专利技术的一株阳性CHO细胞克隆(CHO-ChIFN-P，中 国仓鼠卵巢细胞(C7n'e/Za脂^ Ovw^ //))于2008年3月25日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC,中国，北 京)，保藏号为CGMCCNo.2414。在25ci^的细胞瓶(5ml培养液)中， 重组ChIFN-P的累积表达水平达到6.9xl04 AU/ml，每天的表达量可达 4.3x104 AU (antiviral units) /ml或0.043AU/个细胞。CHO-ChIFN-卩细胞 可在无G418压力筛选下稳定表达至少20代。表达的重组ChIFN-p可以诱 导原代鸡胚成纤维细胞(CEFs)表达鸡Mx蛋白。此外，其还可以完全保 护CEFs细胞抵抗1000 TCIDsq的禽流感病毒(H5N1亚型强毒株)的感染。 综上，本专利技术中CHO-ChIFN-p细胞稳定、高效表达的重组ChFN-P具有 天然鸡I型干扰素的生物学活性，具有良好的基础和应用研究价值。本专利技术的专利性新颖性与已经使用的表达脊椎动物鸡卩干扰素的技术相比(目前干扰素表达 所采用的表达系统主要是原核、酵母表达系统，使用CHO表达脊椎动物 鸡P干扰素的国内外未见报道)，表达的技术路线完全不同。表达的产物 在折叠、糖基化、翻译后修饰、稳定性、比活性上要大大优于已有的技术 手段(原核、酵母)。创造性1、与已有的原核和酵母表达系统比较，本专利技术CHO表达系统表达出 的干扰素在蛋白的折叠、糖基化等翻译后修饰上最接近于天然干扰素，比 活性更高，约是原核的10倍；2、由于我们的目的是表达最接近天然活性的干扰素，而农业部颁布的 兽用生物制品质量标准中的天然鸡白细胞干扰素是以鸡新城疫病毒诱导鸡白细胞获得的，制作工艺和产品成分复杂，最终产品的活性约10000AU mU1。与此相比较，本专利技术的表达系统的ChIFN-P的表达水平是其70 倍或以上，且工艺简单、产品成分容易控制，具有极大的优越性。综上因此以CHO表达的鸡卩干扰素与原核和酵母表达的相比较具 有极大的优越性和创造性。附图简述附图说明图1.重组ChIFN-卩在CHO-ChIFN-卩细胞中的表达；图2.传代次数对CHO-ChIFN-p细胞表达重组ChIFN-卩的影响；图3.免疫印迹检测ChlFN-(3cHo诱导CEFs细胞Mx蛋白的表达。在用 ChlFN-(3cHo刺激后在CEFs细胞中的Mx蛋白的表达是剂量依赖型的。在 缺少(0)或存在(6.9X10-2至6.9x103 AU/ml， A至F)的ChIFN-(3CH0下刺激 CEF细胞，并通过Western blotting分析，A, 6.9X 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表达鸡β干扰素的ＣＨＯ细胞系，其含有编码鸡β干扰素的基因。
【技术特征摘要】
1.一种表达鸡β干扰素的CHO细胞系，其含有编码鸡β干扰素的基因。2. 根据权利要求1所述的CHO细胞系，其中所述鸡p干扰素的氨基 酸序列如SEQ ID NO: 2所示。3. 根据权利要求1所述的CHO细胞系，其中所述编码鸡P干扰素的 基因如SEQ ID NO: l所示。4. 根据权利要求1-3任一项所述的CHO细胞系，其中在所述编码鸡卩 干扰素的基因之前加入了 Kozak序列。5. 根据权利要求1所述的CHO细胞系，其是保藏号为CGMCC No. 2414的CHO细胞系。6. —种生产鸡(3干扰素标准品的方法，该方...
【专利技术属性】
技术研发人员：步志高，陈伟业，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]
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