【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分析检测，特别涉及一种发酵液中赖氨酸浓度的检测试剂、检测试剂盒及方法。
技术介绍
1、l-赖氨酸(l-lysine)对人和动物的生长发育具有重要作用，是人和动物的必需氨基酸之一。由于在人和动物体内不能通过转氨作用合成，只能通过食物补充，且需求量高，故被称为第一限制性氨基酸。赖氨酸广泛应用于食品加工、医药制剂、饲料添加剂等方面。
2、目前常用的赖氨酸检测方法主要有酶法、高效液相色谱(hplc)检测法和化学法(茚三酮法)。酶法主要是通过赖氨酸在特异的氧化酶催化下发生氧化还原反应，其电子产物在生物传感器电极表面形成电流从而进行测定，检测准确度和应用性受酶活力和酶价格的限制；hplc方法采用2，4-二硝基氟苯(dnfb)、1-氟-2，4-二硝基苯基-5-l-丙氨酰胺(fdaa)等衍生化试剂，虽然能够精确区分和测定d-/l-型赖基酸的含量，但对仪器精密度和操作人员要求极高，并且易受样品中杂质成分的干扰，不适合工业发酵液中赖氨酸的检测；化学法主要指茚三酮方法，基本原理为：氨基酸与水合茚三酮共同加热后可发生氧化脱氨反应，生成nh3与酮酸；加热过程中酮酸裂解，放出co2，自身变为少一个碳的醛，水合茚三酮变为还原型茚三酮。nh3与水合茚三酮及还原茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物。
3、酿酒酵母由于培养简单且遗传操作体系成熟，易于被改造，而成为重要的代谢工程底盘细胞，被用于多种化学品的生产。然而由于酵母发酵液中赖氨酸含量低，传统的茚三酮方法对于低浓度发酵液的测定灵敏度不高，误差较大，测试时间长，因此亟需一种在赖
技术实现思路
1、针对现有技术中的缺陷，本专利技术提出了一种发酵液中赖氨酸浓度的检测试剂或检测试剂盒，所述检测试剂或检测试剂盒包含溶液i、溶液ii；
2、所述溶液i由溶液a和溶液b组成，其中所述溶液a由35％～40％的甲基溶纤剂、2.8～3％氯化铁溶液、其余为kcl缓冲液组成，所述溶液b由10g/l茚三酮、其余为kcl缓冲液组成；
3、溶液i中溶液a和溶液b的体积比为(0.64～0.68)：(0.35～0.39)；优选地，所述溶液a和所述溶液b的总体积为1.03ml；
4、所述溶液ii由40～50％二甲基亚砜和50～60％去离子水组成。
5、本专利技术还提供一种发酵液中赖氨酸浓度的检测方法方法，包括如下步骤：
6、(1)标准曲线的制作：将赖氨酸标准溶液稀释成5～10个浓度梯度，加入所述溶液i，混合、100℃加热30～40min，自然冷却至室温，加入所述溶液ii混合均匀，测定吸光值a；取5～10组标准溶液赖氨酸浓度c对应吸光值a，制作标准曲线，回归方程公式如下：
7、
8、
9、得到曲线对应解析式为y＝kx+b；
10、其中，y为吸光值a；为吸光值平均值；x为标准溶液赖氨酸浓度c，单位为mmol/l；为各组标准溶液赖氨酸浓度平均值；k为标准曲线解析式系数；b为标准曲线在y轴上的截距，即赖氨酸浓度为0时的吸光度；n的取值范围为5～10；i的取值范围为1～n；
11、(2)发酵液的处理：将离心后的发酵液以旋蒸的方式进行浓缩除去多余的水分，用去离子水重悬；菌株沉淀用去离子水洗涤重悬后，100℃下加热20min；
12、(3)样品溶液的制备：将(2)得到的发酵液与所述溶液i混合，在100℃下加热30～40min，用自来水冷却至室温，得到显色样品；将显色样品与所述溶液ii混合均匀，测定吸光值；
13、(4)赖氨酸浓度的计算：根据样品溶液的吸光值a样，利用(1)所述标准曲线解析式计算样品的赖氨酸浓度c样；
14、c样的具体计算公式如下：
15、
16、进一步的，步骤(1)中赖氨酸标准溶液与溶液i的体积比为(0.015～0.02)：(1.03～1.035)；优选地，所述发酵液与所述溶液i的总体积为1.05ml。
17、进一步的，步骤(1)中溶液ii与赖氨酸标准溶液的体积比为1：1。
18、进一步的，步骤(1)中吸光值的测定波长为470nm。
19、进一步的，步骤(2)中旋蒸的温度为30～60℃。
20、进一步的，步骤(3)中发酵液与溶液i的体积比为(0.015～0.02)：(1.03～1.035)；优选地，所述发酵液与所述溶液i的总体积为1.05ml。
21、进一步的，步骤(3)中显色样品与溶液ii的体积比为1：1。
22、综上，与现有技术相比，本专利技术达到了以下技术效果：
23、(1)本专利技术通过对发酵菌液进行前处理，保证菌液中赖氨酸的浓度在检测限内，确保浓度测定的准确性。
24、(2)本专利技术的赖氨酸标准溶液在显色结束后采用自然冷却的方式，并优化了标准溶液的最佳稀释倍数，利用dmso进行2倍稀释，极大幅度提高了标准曲线的拟合度，降低了试剂的消耗，节约实验时间。
25、(3)本专利技术通过采用kcl溶液作为体系的缓冲液，当赖氨酸标准溶液浓度在0～10mmol/l范围内时，在470nm处下测量得到的标品浓度更符合其真实浓度的线性增加。
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1.一种发酵液中赖氨酸浓度的检测试剂或检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂或检测试剂盒包含溶液I和溶液II；
2.一种发酵液中赖氨酸浓度的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中赖氨酸标准溶液与溶液I的体积比为(0.015～0.02)：(1.03～1.035)。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中溶液II与赖氨酸标准溶液的体积比为1：1。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中吸光值的测定波长为470nm。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中旋蒸的温度为30～60℃。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中发酵液与溶液I的体积比为(0.015～0.02)：(1.03～1.035)。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中显色样品与溶液II的体积比为1：1。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵液为酵母发酵液。
【技术特征摘要】
1.一种发酵液中赖氨酸浓度的检测试剂或检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂或检测试剂盒包含溶液i和溶液ii；
2.一种发酵液中赖氨酸浓度的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中赖氨酸标准溶液与溶液i的体积比为(0.015～0.02)：(1.03～1.035)。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中溶液ii与赖氨酸标准溶液的体积比为1：1。
5.根据权利要求2所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘涛涛，李天一，田普阳，
申请(专利权)人：深圳良合生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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