【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于同时检测螺旋霉素和替米考星的拉曼光谱试纸条及其应用，属于兽药残留的免疫化学速测技术。
技术介绍
1、螺旋霉素(spiramycin)是由一大中心环和一种或多种糖苷键糖分子组成的亲脂性及碱性抗生素，可用于治疗由葡萄球菌等革兰阳性菌和某些革兰阴性菌比如脑膜炎双球菌引发的耳、鼻、喉感染，是动物源性食品中主要的抗生素残留之一。人体长期暴露于这种抗生素下，即使浓度较低也会导致过敏反应、中毒和抗生素耐药性等不良反应的发生。
2、替米考星(tilmicosin)是泰乐菌素的一种水解产物半合成抗生素，主要作为兽用抗生素药被普遍用作饲草的添加剂和动物治病方面；其抗菌谱广，对支原体抗菌最强，可用以医治由耐青霉素细菌引发的感染，在药效及药物残留方面更优，有逐渐取代泰乐菌素的趋势。
3、目前，针对螺旋霉素和替米考星兽药残留的检测方法有高效液相色谱法、液质联用、微生物法、酶联免疫吸附(elisa)、胶体金免疫技术等。这些方法都各有优缺点，高效液相色谱法和液质联用的分析方法，样品前处理方法繁琐复杂，仪器昂贵，检测成本高，一般作为实验室分析检测的重要确证方法。微生物法不同批菌种对测定结果有较大影响，且分析周期长，灵敏度低。elisa法主要是以固相材料为载体来吸附抗原或抗体的一种免疫分析方法，已广泛用于抗生素残留的快速筛选测定，虽然在一定程度上缩短了检测时间，但仍然需要专门的仪器，操作过程仍较复杂。更为主要的是，以上检测方法均为实验室方法，难在现场应用，不利于推广使用。而胶体金免疫层析法可以满足现场快速的要求，但是
4、同时，螺旋霉素和替米考星在化学结构上有一定相似性，均具有环状结构，且都含有四环素骨架，这进一步加大了在同一样品中准确区分螺旋霉素和替米考星的难度，这也导致暂无现有技术能够同时准确快速地检测螺旋霉素和替米考星，并对其进行定量。
5、因此，提供一种能够同时、快速、准确、方便地定量螺旋霉素和替米考星的检测方法，具有更高的实用性，对保障食品安全、监管合规、提高生产效率以及促进科学研究都有重要的意义和价值。
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术提供了一种用于同时检测螺旋霉素和替米考星的拉曼光谱试纸条及其应用，本专利技术的拉曼光谱试纸条灵敏度高、特异性强、操作简便，检测快速、准确、适合现场使用且能够同时检测螺旋霉素和替米考星。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种用于同时检测螺旋霉素和替米考星的表面增强拉曼光谱免疫层析试纸条，包括检测卡和检测液；
3、检测卡包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和pvc背衬；其中，pvc背衬上依次粘附有样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；样品垫与硝酸纤维素膜之间有搭接，样品垫在上方，硝酸纤维素膜在下方；硝酸纤维素膜与吸水垫之间有搭接，吸水垫在上方，硝酸纤维素膜在下方；硝酸纤维素膜上分别包被有螺旋霉素抗原的检测线t1、替米考星抗原的检测线t2和羊抗鼠igg的质控线c；
4、检测液包括au4-mba@ag-abi溶液和au4-mba@ag-abii溶液；其中，au4-mba@ag-abi溶液的制备方法包括：调节au4-mba@ag nps溶液ph为8～9，加入螺旋霉素抗体、促凝剂na2so4溶液和bsa溶液，搅拌得到au4-mba@ag-abi溶液；au4-mba@ag-abii溶液的制备方法包括：调节au4-mba@ag nps溶液ph为8～9，加入替米考星抗体、促凝剂na2so4溶液和bsa溶液，搅拌得到au4-mba@ag-abii溶液。
5、在一种实施方式中，制备au4-mba@ag-abi溶液时，促凝剂na2so4溶液的浓度为0.1～0.2mol/l，添加量为18～20μl/ml au4-mba@ag nps溶液；制备au4-mba@ag-abii溶液时，促凝剂na2so4溶液的浓度为0.1～0.2mol/l，添加量为18～20μl/ml au4-mba@ag nps溶液。
6、在一种实施方式中，在制备螺旋霉素抗原的检测线t1时，使用的螺旋霉素抗原溶液的浓度为0.5～2mg/ml；在制备替米考星抗原的检测线t2时，使用的替米考星抗原溶液的浓度为0.5～2mg/ml；在制备质控线c时，使用的羊抗鼠igg抗体溶液的浓度为1～2mg/ml。
7、在一种实施方式中，所述检测线t1距离质控线c 4～6mm，检测线t2距离质控线c 8～10mm。
8、在一种实施方式中，所述au4-mba@ag nps溶液的制备包括如下步骤：
9、(1)制备纳米金颗粒溶液aunps
10、将1～2ml 1～2％(w/v 1g/100ml)的氯金酸溶液加入100～200ml水中，搅拌，加入1.5～3ml质量分数为1～2％柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌，115～120℃加热10～15min直至溶液颜色不再变化，冷却，得到纳米金颗粒溶液aunps；
11、(2)纳米金颗粒表面修饰4-巯基苯甲酸(4-mba)
12、取10～15ml步骤(1)制备的纳米金颗粒溶液，加入10～15μl 1～2mmol/l的4-mba溶液，搅拌，得到au4-mbanps溶液；
13、(3)au4-mba@ag nps的制备
14、取10～15ml步骤(2)制备的au4-mbanps溶液，加入2～3ml 0.1～0.3mol/l抗坏血酸溶液，边搅拌边滴加2.5～5ml 1～2mmol/l的硝酸银溶液，20～30s一滴，滴加完成后，离心，加水复溶，得到au4-mba@ag nps溶液。
15、本专利技术的第二个目的是提供一种同时定量检测螺旋霉素和替米考星的方法，包括步骤：
16、将au4-mba@ag-abi溶液、au4-mba@ag-abii溶液和待测样品混合，得到混合液，将混合液喷涂于任一上述的表面增强拉曼光谱免疫层析试纸条的样品垫上，使用拉曼光谱仪检测t1线和t2线的相对拉曼光强度(抑制率)，并根据螺旋霉素和替米考星的标准曲线计算得到螺旋霉素和替米考星的浓度。
17、在一种实施方式中，拉曼光谱仪的参数为：激发波长785nm，激光功率40mw，积分时间4s。
18、在一种实施方式中，螺旋霉素的标准曲线为：y＝-19.47x+23.85，其中，y为相对拉曼光强度％，x为螺旋霉素浓度ng/ml的log10对数值；替米考星的标准曲线为：y＝-15.53x+31.22，其中，y为相对拉曼光强度％，x为替米考星浓度ng/ml的log10对数值。
19、在一种实施方式中，au4-mba@ag-abi溶液、au4-mba@ag-abii溶液和待测样品的体积比为3～5：2～5：100～200。
20、在一种实施方式中，待测样品包括奶制品、肉制品。
21、本专利技术的第三个目的是提供一种同时定性检测螺旋霉素和替米考星的方法，包括步骤：
22、将au4-mba@ag本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于同时检测螺旋霉素和替米考星的表面增强拉曼光谱免疫层析试纸条，其特征在于，包括检测卡和检测液；
2.根据权利要求1所述的表面增强拉曼光谱免疫层析试纸条，其特征在于，制备Au4-MBA@Ag-AbI溶液时，促凝剂Na2SO4溶液的浓度为0.1～0.2mol/L，添加量为18～20μL/mL Au4-MBA@Ag NPs溶液；制备Au4-MBA@Ag-AbII溶液时，促凝剂Na2SO4溶液的浓度为0.1～0.2mol/L，添加量为18～20μL/mL Au4-MBA@Ag NPs溶液。
3.根据权利要求1所述的表面增强拉曼光谱免疫层析试纸条，其特征在于，在制备螺旋霉素抗原的检测线T1时，使用的螺旋霉素抗原溶液的浓度为0.5～2mg/mL；在制备替米考星抗原的检测线T2时，使用的替米考星抗原溶液的浓度为0.5～2mg/mL；在制备质控线C时，使用的羊抗鼠IgG抗体溶液的浓度为1～2mg/mL。
4.根据权利要求1所述的表面增强拉曼光谱免疫层析试纸条，其特征在于，检测线T1距离质控线C 4～6mm，检测线T2距离质控线C 8～10mm。>
5.一种同时定量检测螺旋霉素和替米考星的方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，螺旋霉素的标准曲线为：y＝-19.47x+23.85，其中，y为相对拉曼光强度％，x为螺旋霉素浓度ng/mL的Log10对数值；替米考星的标准曲线为：y＝-15.53x+31.22，其中，y为相对拉曼光强度％，x为替米考星浓度ng/mL的Log10对数值。
7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，混合液中Au4-MBA@Ag-AbI溶液、Au4-MBA@Ag-AbII溶液和待测样品的体积比为3～5：2～5：100～200。
8.根据权利要求5所述方法，其特征在于，待测样品包括奶制品、肉制品。
9.一种同时定性检测螺旋霉素和替米考星的方法，其特征在于，包括如下步骤：
10.一种提高表面增强拉曼光谱免疫层析试纸条检测螺旋霉素和替米考星灵敏度的方法，其特征在于，使用权利要求1～4任一所述表面增强拉曼光谱免疫层析试纸条。
...【技术特征摘要】
1.一种用于同时检测螺旋霉素和替米考星的表面增强拉曼光谱免疫层析试纸条，其特征在于，包括检测卡和检测液；
2.根据权利要求1所述的表面增强拉曼光谱免疫层析试纸条，其特征在于，制备au4-mba@ag-abi溶液时，促凝剂na2so4溶液的浓度为0.1～0.2mol/l，添加量为18～20μl/ml au4-mba@ag nps溶液；制备au4-mba@ag-abii溶液时，促凝剂na2so4溶液的浓度为0.1～0.2mol/l，添加量为18～20μl/ml au4-mba@ag nps溶液。
3.根据权利要求1所述的表面增强拉曼光谱免疫层析试纸条，其特征在于，在制备螺旋霉素抗原的检测线t1时，使用的螺旋霉素抗原溶液的浓度为0.5～2mg/ml；在制备替米考星抗原的检测线t2时，使用的替米考星抗原溶液的浓度为0.5～2mg/ml；在制备质控线c时，使用的羊抗鼠igg抗体溶液的浓度为1～2mg/ml。
4.根据权利要求1所述的表面增强拉曼光谱免疫层析试纸条，其特征在于，检测线t1距离质控线c 4～6mm，...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚卫蓉，赵翔，马宁，常化仿，章祥，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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