【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种能够长期维持的成熟化的心肌细胞层的制造方法。本专利技术还涉及一种能够长期维持的成熟化的心肌细胞层。本专利技术还涉及一种使用了上述的心肌细胞层的用于评价药物候选物质的试剂盒、移植材料、以及评价药物候选物质的方法。
技术介绍
1、近年来，改善从人诱导多能干细胞(人ips细胞)向心肌细胞的分化衍生法，心肌细胞的纯度或成本等课题正在得到解决。但是，已知所获得的心肌细胞为人胎儿期的未成熟的心肌细胞。作为使未成熟的心肌细胞成熟化的方法，报告有使用器件的刺激法或物理刺激方法(例如，电刺激、或机械刺激)(非专利文献1～6)。在这些报告中，在构建具有三维结构的条纹状或环状的心肌组织之后，从外部施加机械或电刺激，使心肌组织成熟化。但是，在从外部施加机械刺激或电刺激的成熟化方法中，存在对细胞产生损伤、无法长期维持心肌组织、并且控制装置复杂且难以操作等问题。
2、作为更简便的方法，已知构建三维细胞环来促进心肌细胞的成熟的方法(专利文献1)。但是，已知通过该方法成熟的心肌细胞的代谢非常高，在三维结构的状态下向组织中部的细胞提供营养变得不足，细胞难以长期维持(非专利文献7)。
3、现有技术文献
4、非专利文献
5、非专利文献1：nature volume 556，pages239-243(2018)
6、非专利文献2：nature methods volume 10，pages781-787(2013)
7、非专利文献3：nature communications v
8、非专利文献4：scientific reports volume 10，article number：6919(2020)
9、非专利文献5：circulation.2017may 9；135(19)：1832-1847
10、非专利文献6：scientific reports volume 4，article number：4781(2014)
11、非专利文献7：communications biology volume 3，article number：122(2020)
12、专利文献
13、专利文献1：国际公开wo2018/124210号公报
技术实现思路
1、专利技术要解决的技术课题
2、本专利技术要解决的课题在于提供一种未使用复杂的控制装置而能够使心肌细胞成熟并且能够长期维持的心肌细胞层的制造方法及心肌细胞层。本专利技术要解决的课题在于提供一种使用了上述的心肌细胞层的用于评价药物候选物质的试剂盒、移植材料、以及评价药物候选物质的方法。
3、用于解决技术课题的手段
4、本专利技术人为了解决上述课题进行深入研究的结果，发现了通过将细胞培养为二维细胞层(单层)而不是如专利文献1记载的三维细胞环来解决心肌细胞的成熟之外还能够解决营养提供的问题。另外，已知心肌细胞的成熟化需要以闭环形状(例如，环形状)培养心肌细胞，但本专利技术人发现了在闭环形状的周长与心肌细胞的传导速度(与心脏的收缩有关的参数)满足规定的关系时细胞能够长期维持。本专利技术是根据上述发现而完成的。
5、即，根据本专利技术可提供以下专利技术。
6、＜1＞一种心肌细胞层的制造方法，其包括以下(1)～(3)的工序；
7、(1)将从多能干细胞衍生的心肌细胞以单层播种于以下(1-1)所示的形状的播种面来形成心肌细胞层，
8、(1-1)在将播种面的水平方向上的扩展设为平面图形的情况下，其形状为将具有相同扩展的任意形状的第一平面图形的至少一部分以具有相同扩展的其他任意形状的第二平面图形按照不与上述任意形状的第一平面图形的外周相接的方式挖出而成的形状，且为上述第一平面图形的外周的长度与上述第二平面图形的外周的长度的平均值满足下述式的形状；
9、x≥v/10，
10、式中，x表示上述第一平面图形的外周的长度与上述第二平面图形的外周的长度的平均值，其单位为cm，v表示从上述多能干细胞衍生的心肌细胞的传导速度，其单位为cm·s-1；
11、(2)使至少1个电信号或钙信号在上述心肌细胞层内循环而进行，
12、(3)在维持上述(2)的状态下培养8天以上。
13、＜2＞根据＜1＞所述的制造方法，其中，
14、多能干细胞为诱导多能干细胞或胚胎多能干细胞。
15、＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的制造方法，其中，
16、心肌细胞层中的β-mhc的表达量为正常成人心肌细胞的表达量的10％以上。
17、＜4＞根据＜1＞至＜3＞中任一项所述的制造方法，其中，
18、心肌细胞层中的connexin-43的表达量为未用循环波进行处理的对照细胞的表达量的1.5倍以上。
19、＜5＞根据＜1＞至＜4＞中任一项所述的制造方法，其中，
20、心肌细胞层中的传导速度为10cm·s-1以上。
21、＜6＞根据＜1＞至＜5＞中任一项所述的制造方法，其中，
22、来自心肌细胞层的vegf分泌量为来自未用循环波进行处理的对照细胞的vegf分泌量的2倍以上。
23、＜7＞根据＜1＞至＜6＞中任一项所述的制造方法，其中，
24、与未用循环波进行处理的对照细胞相比，心肌细胞层的缺氧耐性提高。
25、＜8＞根据＜1＞至＜7＞中任一项所述的制造方法，其中，
26、第一平面图形为圆，第二平面图形为具有比第一平面图形的圆小的直径的圆。
27、＜9＞根据＜1＞至＜7＞中任一项所述的制造方法，其中，
28、第一平面图形为从圆以与圆的外周相接的方式切出大致矩形而成的形状，第二平面图形为蓝道环的形状，
29、第一平面图形的至少一部分根据第二平面图形挖空，以便在蓝道环的切口之间插入上述矩形。
30、＜10＞根据＜1＞至＜7＞中任一项所述的制造方法，其中，
31、第一平面图形为凹型，第二平面图形为比第一平面图形小的凹型。
32、＜11＞根据＜1＞至＜10＞中任一项所述的制造方法，其中，
33、心肌细胞层中的选自tnni3、itga7、igf1、scn5a及kcnj11的1个以上的心肌成熟标记的表达量为未用循环波进行处理的对照细胞中的表达量的1.3倍以上。
34、＜12＞根据＜1＞至＜11＞中任一项所述的制造方法，其还包括与成纤维细胞共同培养的工序。
35、＜13＞根据＜1＞至＜12＞中任一项所述的制造方法，其中，
36、在生物可降解性或非生物可降解性的支架上形成心肌细胞层。
37、＜14＞根据＜1＞至＜13＞中任一项所述的方法，其中，
38、工序(1)中的心肌细胞的播种密度本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种心肌细胞层的制造方法，其包括以下(1)～(3)的工序：
2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，
3.根据权利要求1或2所述的制造方法，其中，
4.根据权利要求1至3中任一项所述的制造方法，其中，
5.根据权利要求1至4中任一项所述的制造方法，其中，
6.根据权利要求1至5中任一项所述的制造方法，其中，
7.根据权利要求1至6中任一项所述的制造方法，其中，
8.根据权利要求1至7中任一项所述的制造方法，其中，
9.根据权利要求1至7中任一项所述的制造方法，其中，
10.根据权利要求1至7中任一项所述的制造方法，其中，
11.根据权利要求1至10中任一项所述的制造方法，其中，
12.根据权利要求1至11中任一项所述的制造方法，其还包括与成纤维细胞共同培养的工序。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的制造方法，其中，
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，
15.根据权利要求1至14中任一项所
16.一种心肌细胞层，其通过权利要求1至15中任一项所述的制造方法来获得。
17.一种心肌细胞层，其具有以下(1)～(5)的特征：
18.一种试剂盒，其用于评价药物候选物质，所述试剂盒包含权利要求16或17所述的心肌细胞层。
19.一种移植材料，其包含权利要求16或17所述的心肌细胞层。
20.一种评价药物候选物质的方法，其包括如下工序：
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种心肌细胞层的制造方法，其包括以下(1)～(3)的工序：
2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，
3.根据权利要求1或2所述的制造方法，其中，
4.根据权利要求1至3中任一项所述的制造方法，其中，
5.根据权利要求1至4中任一项所述的制造方法，其中，
6.根据权利要求1至5中任一项所述的制造方法，其中，
7.根据权利要求1至6中任一项所述的制造方法，其中，
8.根据权利要求1至7中任一项所述的制造方法，其中，
9.根据权利要求1至7中任一项所述的制造方法，其中，
10.根据权利要求1至7中任一项所述的制造方法，其中，
11.根据权利要求1至10中任一项所述的制造方法，其中，...
【专利技术属性】
技术研发人员：三好隼人，刘莉，泽芳树，李俊君，宫川繁，武田真季，
申请(专利权)人：富士胶片株式会社，
类型：发明
国别省市：
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