本发明专利技术公开了一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，测试方法为：体外培养皮脂腺细胞传代细胞系，将待测样品加入细胞中进行测试，首先测试样品的细胞毒性，再选择无细胞毒性的浓度，采用荧光染色技术，结合荧光检测设备进行油脂抑制测试，通过统计学手段分析评价样品的控油功效。旨在提供一种采用细胞作为检测手段用于评价化妆品控油功效的测试方法，该方法采用细胞替代人体试验，符合实验动物“3R”原则，测试方法经济快捷，测试过程可控，测试体系标准化，避免因人体个体差异引起的较大的结果偏差。本测试方法还通过多次实际应用，建立了控油功效的判定标准；本测试方法用于评价化妆品及其原料的控油功效评价，属于化妆品测试技术领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种测试方法，具体地说，是一种用体外细胞评价化妆品及其原料控油功效的测试方法；属于化妆品测试。
技术介绍
0、技术背景
1、化妆品控油功效，指使用化妆品后有助于减缓施用部位皮脂分泌和沉积，或使施用部位出油现象不明显。具有控油功效的化妆品，应当通过化妆品功效宣称评价试验方式，可以同时结合文献资料或研究数据分析结果，进行功效宣称评价。根据化妆品功效宣称评价项目要求，控油功效可采用人体功效评价试验、消费者使用测试和实验室试验三种方法中任一种方法进行评价。
2、目前，针对化妆品控油功效的评价，还没有统一的国家标准和行业标准。人体功效评价是化妆品控油功效的一种常用方法，但该方法周期长，费用高，且在测试过程中，在受试者的筛选上存在一定的困难，受试者在使用样品过程中的监督问题、人员个体差异问题均严重影响到测试结果；在体外测试方法中，目前也没有统一的标准，部分测试方法存在重复性差，科学性不足、误差大等问题。
3、为了科学、有效地进行化妆品及原料的功效测试，开发一种细胞测试方法，用于化妆品及原料的控油功效评价十分有必要。
技术实现思路
1、为此，本专利技术的目的是通过检测样品对人皮脂腺细胞油脂合成的抑制作用，从而评价样品的控油功效；该方法经济快捷，测试过程可控，测试体系标准化，可以避免因人体个体差异引起较大的结果偏差。
2、一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，依次包括下述步骤：
3、步骤1、传代培养细胞；
>4、步骤2、样品细胞毒性测试5、将样品用细胞培养基稀释成4～8个不同浓度，加入按步骤1培养好的细胞板中，测定样品的细胞毒性，根据测定结果计算细胞活力，筛选出细胞活力在85％或以上、细胞形态与细胞对照组无明显差异的浓度，作为无明显细胞毒性的样品浓度；
6、步骤3、样品油脂抑制测试
7、将步骤2将培养好的长满单层细胞板，弃去培养液，用pbs洗1～2次，将样品用细胞培养基稀释至无明显细胞毒性的浓度，加入细胞板中，50μl/孔，同时设空白对照组(bc)、阴性对照组(nc)和阳性(pc)对照组。其中空白对照组加100μl/孔的细胞培养基，阴性对照组加入50μl/孔的细胞培养基，阳性对照组加50μl/孔的阳性对照物；加样完毕，除了空白对照组，其他组均加入50μl/孔的造模剂，置温度37℃、co2浓度5.0％条件下培养20～48h。培养结束后，弃去细胞培养液，用pbs轻轻冲洗2次，弃去，每孔加入100μl的荧光染色液，避光反应10～30min，用荧光酶标仪检测每孔的荧光强度；
8、步骤4、结果统计分析
9、油脂抑制率(％)＝[1-(mfi样品-mfibc)/(mfinc-mfibc)]×100
10、式中：
11、mfi样品指样品组的荧光强度均值；
12、mfinc为阴性对照组的荧光强度均值；
13、mfibc为空白对照组的荧光强度均值；
14、步骤5、结果判定
15、用统计学软件进行统计及显著性分析，计算p值，p＜0.05表示具有显著性差异。当空白对照组(bc组)与阴性对照组(nc组)相比p小于0.05时，具有显著差异，试验成立。样品组油脂抑制率为正数且与阴性对照组(nc组)相比具有显著差异(p＜0.05)，可判定为样品具有控油功效。
16、具体地，所述细胞为人皮脂腺细胞，本专利技术所述的人皮脂腺细胞，来源于各个细胞保藏中心或其他商业模式；
17、进一步地，所述的传代培细胞的过程为：取成长良好单层的细胞，弃去细胞培养基，用新鲜无血清培养基或pbs轻轻清洗1次，弃去，加入适量(以浸没所有细胞单层表面为准)的0.25％edta-胰酶溶液消化1～5min，弃去edta-胰酶溶液，加入5～10ml含10％牛血清的dmem培养基，吹打分散细胞，使细胞均匀分散。取细胞悬液计数，根据细胞数调整细胞浓度至5.0×104～2.0×105cell/ml，放置温度37℃、co2浓度5.0％条件下培养24～72h。
18、进一步地，细胞毒性测试的具体过程为：在进行细胞毒性测试前，调整人皮脂腺细胞细胞浓度至5.0×104～2.0×105cell/ml，加入96孔细胞培养板中，100μl/孔。将细胞板盖好，封边，置温度37℃、co2浓度5.0％条件下培养24±4h，至细胞融合度达80％以上时用于细胞毒性检测；将培养好的细胞板，弃去培养液；将样品用细胞培养基稀释成4～8个不同浓度，加入细胞板中，同时设不加样品的细胞对照组、不加细胞及样品的空白对照组，100μl/孔，培养20～48h后，显微镜下观察细胞状态，弃去培养液，洗细胞板1～2次，加入mtt溶液，继续培养2～6h，弃去培养液，加入150μl/孔的dmso，震荡5～10min，于570nm处测定吸光值。根据吸光值测定结果采用公式细胞活力(％)＝(od样品-od空白)/(od阴性-od空白)×100计算细胞活力，其中od样品为样品组的od值，od阴性为细胞对照组的od值，od空白为空白组的od值。根据细胞活力结果，筛选出细胞活力在85％或以上的样品浓度，作为无明显细胞毒性的样品浓度供下一步实验；
19、进一步地，样品油脂抑制测试的具体过程为：重新培养细胞，调整细胞浓度至5.0×104～2.0×105cell/ml，加入96孔细胞培养板中，100μl/孔。将细胞板盖好，封边，置温度37℃、co2浓度5.0％条件下培养24±4h用于细胞油脂抑制测试；将上一步培养好的细胞板，弃去培养液，用pbs洗1～2次，将样品用细胞培养基稀释至无明显细胞毒性的浓度，加入细胞板中，50μl/孔，同时设空白对照组、阴性对照组和阳性对照组。其中空白对照组(bc)加100μl/孔的细胞培养基，阴性对照组(nc)加入50μl/孔的细胞培养基，阳性对照组(pc)加50μl/孔的阳性对照物；加样完毕，除了空白对照组，其他组均加入50μl/孔的造模剂，置温度37℃、co2浓度5.0％条件下培养20～48h。培养结束后，弃去细胞培养液，用pbs轻轻冲洗1～2次，弃去，每孔加入100μl的荧光染色液，避光反应10～30min，用荧光酶标仪检测荧光强度。
20、进一步地，所述的细胞培养板为96孔细胞培养板。
21、进一步地，所述的培养是将细胞板盖好，封边，置温度37℃、co2浓度5.0％条件下培养24～72h。
22、进一步地，选择无明显细胞毒性的样品浓度进行细胞油脂抑制测试时，可根据实验需要选择多个不同的浓度。
23、进一步地，所述造模剂为睾酮和亚油酸的混合液。
24、进一步地，所述造模剂的配制方法为：用无水乙醇分别配制睾酮溶液和的亚油酸溶液，再混合即得。
25、进一步地，所述睾酮溶液和亚油酸溶液的混合比例按体积为1：(0.5-2)。
26、进一步地，所述造模剂使用前用细胞培养基稀释10～2000倍。
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【技术保护点】
1.一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，其特征在于，依次包括下述步骤：
2.根据权利要求1所述的一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，其特征在于，所述造模剂为睾酮和亚油酸的混合液。
3.根据权利要求2所述的一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，其特征在于，所述造模剂的配制方法为：用无水乙醇分别配制睾酮溶液和的亚油酸溶液，再混合即得。
4.根据权利要求3所述的一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，其特征在于，所述睾酮溶液和亚油酸溶液的混合比例按体积为1：(0.5-2)。
5.根据权利要求2所述的一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，其特征在于，所述造模剂使用前用细胞培养基稀释10～2000倍。
6.根据权利要求3所述的一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，其特征在于，所述睾酮溶液的浓度为1～100mg/ml，所述亚油酸溶液的浓度为10～200umol/ml。
7.根据权利要求1所述的一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，其特征在于，所述的阳性对照物为地塞米松磷酸钠。
8.根据权利要求7所述的一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，其特征在于，所述阳性对照物的使用方法为：称取地塞米松磷酸钠粉末溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，配制成0.1～10mg/ml的浓度。
9.根据权利要求1所述的一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，其特征在于，所述的荧光染色剂为尼罗红。
10.根据权利要求9所述的一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，其特征在于，所述的荧光染色剂的使用方法为：用DMSO将尼罗红配制成0.5mg/ml的浓度，避光冷冻保存，使用时完全解冻后用PBS稀释10～200倍，现配现用。
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【技术特征摘要】
1.一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，其特征在于，依次包括下述步骤：
2.根据权利要求1所述的一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，其特征在于，所述造模剂为睾酮和亚油酸的混合液。
3.根据权利要求2所述的一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，其特征在于，所述造模剂的配制方法为：用无水乙醇分别配制睾酮溶液和的亚油酸溶液，再混合即得。
4.根据权利要求3所述的一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，其特征在于，所述睾酮溶液和亚油酸溶液的混合比例按体积为1：(0.5-2)。
5.根据权利要求2所述的一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，其特征在于，所述造模剂使用前用细胞培养基稀释10～2000倍。
6.根据权利要求3所述的一种用体外细胞评价化妆品及原料控油功效的方法，其特征在于，所述睾酮...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭沈涛，徐文枫，崔玉矫，张煜玲，牛强，苏潇雨，陈彪，
申请(专利权)人：广东悠质检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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