一种适用于eDNA宏条形码技术物种多样性分析的环境DNA提取试剂盒及方法技术

技术编号：41634733 阅读：6 留言：0更新日期：2024-06-13 02:30

本发明专利技术公开了一种适用于eDNA宏条形码技术物种多样性分析的环境DNA提取试剂盒，裂解介质为纯锆珠，裂解液包括100‑200mM异硫氰酸胍、100‑300mM磷酸氢二钠，溶剂为水；除杂液的组分包括200‑400mM乙酸铵、30‑100mM十二水硫酸铵铝；结合液包含2‑10M盐酸胍；核酸吸附柱为硅胶膜吸附柱，洗涤液I为pH7.5的20‑200mM Tris‑HCl；洗涤液II为体积比75％乙醇溶液；洗脱液的组分包括pH8.0的5‑15mM Tris、pH8.0的0.2‑1mM乙二胺四乙酸二钠。使用该试剂盒提取的环境样本DNA能够满足环境DNA宏条形码技术对环境样本核酸的完整度和多样性有很高的要求。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学，具体涉及一种适用于edna宏条形码技术物种多样性分析的环境dna提取试剂盒及方法。

技术介绍

1、环境dna指的是生物体通过皮肤脱落，残体，体液，配子，粪便，分泌物等方式向环境中释放的游离的dna，而承载这些edna的样本可以是水体，土壤，沉积物，粪便，空气等。环境dna宏条形码技术指利用环境样品(如土壤、沉积物、水体等)中分离的dna进行高通量的多个物种鉴定。使用传统采样方法开展生态学研究，一些物种的样本采集通常比较困难，并且耗时费力，环境dna允许从土壤、水体或是空气中包含的动物毛发、脱落的细胞、粪便、尿液、血液、精子、卵子、根、叶、果实等进行非损伤性取样，从而成功进行遗传检测相比传统的直接采样，该方法成本更低，样本采集受气候条件影响较小，可以进行更大数量的样本收集

2、环境dna宏条形码技术对于环境样本核酸的完整度和多样性有很高的要求，因此，需要一种能够获得全面且完整dna的提取方法提取环境样品dna，用于edna宏条形码技术进行物种多样性分析。

技术实现思路

1、为了解决上述问题中的至少一种，本专利技术提供了一种适用于edna宏条形码技术物种多样性分析的环境dna提取试剂盒及方法。

2、为了达到上述目的，本专利技术采用了如下技术手段：

3、本专利技术的第一方面提供了一种适用于edna宏条形码技术物种多样性分析的环境dna提取试剂盒，包括裂解介质，裂解液，除杂液，结合液，核酸吸附柱，洗涤液i，洗涤液ii和洗脱液；</p>

4、所述裂解介质为纯锆珠；

5、所述裂解液的组分包括100-200mm异硫氰酸胍、100-300mm磷酸氢二钠，溶剂为水；

6、所述除杂液的组分包括200-400mm乙酸铵、30-100mm十二水硫酸铵铝；

7、所述结合液包含2-10m盐酸胍；

8、所述洗涤液i为ph7.5的20-200mm tris-hcl；

9、所述洗涤液ii为体积比75％乙醇溶液；

10、所述洗脱液的组分包括ph8.0的5-15mm tris、ph8.0的0.2-1mm乙二胺四乙酸二钠。

11、在本专利技术的一些实施方案中，所述裂解介质为0.1mm的95％纯锆珠、0.5mm的95％纯锆珠和3mm的95％纯锆珠的混合珠。

12、在本专利技术的一些实施方案中，所述核酸吸附柱为硅胶膜吸附柱。

13、在本专利技术的一些实施方案中，所述裂解液的组分包括150-250mm异硫氰酸胍、150-250mm磷酸氢二钠，溶剂为水。优选地，裂解液的组分包括200mm异硫氰酸胍、200mm磷酸氢二钠，溶剂为水。

14、在本专利技术的一些实施方案中，所述除杂液的组分包括300-400mm乙酸铵、80-100mm十二水硫酸铵铝。优选地，除杂液的组分包括350mm乙酸铵、100mm十二水硫酸铵铝。

15、在本专利技术的一些实施方案中，所述结合液包含5-8m盐酸胍。优选地，结合液包含6m盐酸胍。

16、在本专利技术的一些实施方案中，所述洗涤液i为ph7.5的50-80mm tris-hcl。优选地，洗涤液i为ph7.5的50mm tris-hcl。

17、在本专利技术的一些实施方案中，所述洗脱液的组分包括ph8.0的8-12mm tris、ph8.0的0.3-0.8mm乙二胺四乙酸二钠。优选地，洗脱液的组分包括ph8.0的10mm tris、ph8.0的0.5mm乙二胺四乙酸二钠。

18、本专利技术的环境dna提取试剂盒可应用在edna宏条形码技术物种多样性分析方面。

19、本专利技术的第二方面提供了一种适用于edna宏条形码技术物种多样性分析的环境dna提取方法，包括如下步骤：

20、s1、适量环境样本加入到装有裂解介质的研磨管中充分研磨；

21、s2、加入裂解液混匀后，55℃水浴裂解使细胞中的dna释放，离心获取上清液；

22、s3、在上清液中加入除杂液，4℃孵育，室温离心，除去样本中的杂质；

23、s4、在上清液中加入结合液涡旋混匀，使样本核酸充分结合；

24、s5、混合液过核酸吸附柱，离心后弃滤液，

25、s6、加入洗涤液i，离心后弃滤液；

26、s7、加入洗涤液ii，离心后弃滤液；

27、s8、加入洗脱液，65℃温育后离心，即得到纯化后的dna。

28、在本专利技术的一些实施方案中，各步骤中的离心转速为10000-12000rpm，时长为1-3min。

29、较佳地：环境dna提取方法，包括如下步骤：

30、s1、适量环境样本加入到装有裂解介质的研磨管中充分研磨；

31、s2、加入裂解液，涡旋混匀15s，55℃水浴10min裂解使细胞中的dna释放，将涡旋仪调到最大转速后混匀5min，室温下12000rpm离心3min获取上清液；

32、s3、在上清液中加入除杂液，4℃孵育5min，室温下12000rpm离心3min，除去样本中的杂质；

33、s4、在上清液中加入结合液涡旋混匀，使样本核酸充分结合；

34、s5、混合液过核酸吸附柱，12000rpm离心1min后弃滤液，

35、s6、加入洗涤液i，12000rpm离心1min后弃滤液；

36、s7、加入洗涤液ii，12000rpm离心1min后弃滤液；

37、s8、加入洗脱液，65℃温育2min，12000rpm离心1min，即得到纯化后的dna。

38、本专利技术的有益效果

39、相对于现有技术，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术方案中，采用不同大小的纯锆珠的碰撞力来实现样本裂解，其中的阳离子表面活性剂和盐环境有利于通过渗透压的改变使得生物样本裂解，从而释放其内含有的核酸，同时阳离子表面活性剂的添加有利于与带负电的核酸与结合物的特异性结合；硫酸铝溶于水后电离出硫酸根和铝离子，水解生成氢氧化铝胶体，胶体的胶粒有很多的表面积，能吸附水中悬浮物，可有效去除混合液中的杂质；采用硅胶膜核酸吸附柱，基于带负电的dna骨架对带正电的滤膜有着很高亲和力，硅胶膜在高盐低ph环境下会选择性的吸附dna，而其他污染物，主要是蛋白质，通过膜洗涤去掉。低盐浓度高ph会释放dna。可以利用硅胶膜的这个特性达到纯化dna的目的。

40、采用本专利技术方案提取的环境dna具有很好的完整度和多样性，同时，利用所提取得到的dna采用不同物种的通用引物进行扩增，能够取得良好的扩增结果，便于利用edna宏条形码技术进行物种多样性分析。

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【技术保护点】

1.一种适用于eDNA宏条形码技术物种多样性分析的环境DNA提取试剂盒，其特征在于：包括裂解介质，裂解液，除杂液，结合液，核酸吸附柱，洗涤液I，洗涤液II和洗脱液；

2.根据权利要求1所述的一种适用于eDNA宏条形码技术物种多样性分析的环境DNA提取试剂盒，其特征在于：所述裂解介质为0.1mm的95％纯锆珠、0.5mm的95％纯锆珠和3mm的95％纯锆珠的混合珠。

3.根据权利要求1所述的一种适用于eDNA宏条形码技术物种多样性分析的环境DNA提取试剂盒，其特征在于：所述核酸吸附柱为硅胶膜吸附柱。

4.根据权利要求1所述的一种适用于eDNA宏条形码技术物种多样性分析的环境DNA提取试剂盒，其特征在于：所述裂解液的组分包括150-250mM异硫氰酸胍、150-250mM磷酸氢二钠，溶剂为水。

5.根据权利要求1所述的一种适用于eDNA宏条形码技术物种多样性分析的环境DNA提取试剂盒，其特征在于：所述除杂液的组分包括300-400mM乙酸铵、80-100mM十二水硫酸铵铝。

6.根据权利要求1所述的一种适用于eDNA宏条形码

7.根据权利要求1所述的一种适用于eDNA宏条形码技术物种多样性分析的环境DNA提取试剂盒，其特征在于：所述洗涤液I为pH7.5的50-80mM Tris-HCl。

8.根据权利要求1所述的一种适用于eDNA宏条形码技术物种多样性分析的环境DNA提取试剂盒，其特征在于：所述洗脱液的组分包括pH8.0的8-12mM Tris、pH8.0的0.3-0.8mM乙二胺四乙酸二钠。

9.一种适用于eDNA宏条形码技术物种多样性分析的环境DNA提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

10.根据权利要求9所述的一种适用于eDNA宏条形码技术物种多样性分析的环境DNA提取方法，其特征在于，各步骤中的离心转速为10000-12000rpm，时长为1-3min。

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【技术特征摘要】

1.一种适用于edna宏条形码技术物种多样性分析的环境dna提取试剂盒，其特征在于：包括裂解介质，裂解液，除杂液，结合液，核酸吸附柱，洗涤液i，洗涤液ii和洗脱液；

2.根据权利要求1所述的一种适用于edna宏条形码技术物种多样性分析的环境dna提取试剂盒，其特征在于：所述裂解介质为0.1mm的95％纯锆珠、0.5mm的95％纯锆珠和3mm的95％纯锆珠的混合珠。

3.根据权利要求1所述的一种适用于edna宏条形码技术物种多样性分析的环境dna提取试剂盒，其特征在于：所述核酸吸附柱为硅胶膜吸附柱。

4.根据权利要求1所述的一种适用于edna宏条形码技术物种多样性分析的环境dna提取试剂盒，其特征在于：所述裂解液的组分包括150-250mm异硫氰酸胍、150-250mm磷酸氢二钠，溶剂为水。

5.根据权利要求1所述的一种适用于edna宏条形码技术物种多样性分析的环境dna提取试剂盒，其特征在于：所述除杂液的组分包括300-400m...

【专利技术属性】
技术研发人员：束浩然，金桃，谢汝祝，梁云乔，陆长坤，束文圣，李绍春，
申请(专利权)人：广东美格基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：

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