一种基于雄激素受体介导原理的检测环境类雄激素毒性当量的ＥＬＩＳＡ试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种基于雄激素受体介导原理的检测环境类雄激素毒性当量的ＥＬＩＳＡ试剂盒。本发明专利技术试剂盒包含：探针，雄激素受体蛋白，结合缓冲液，一抗包被的聚苯乙烯酶标板，酶混合液，底物显色液，终止液，１０×浓缩洗涤液，标准品，质控品。所述探针为５′端用生物素标记的双链ＤＮＡ，该序列含有至少一个雄激素反应元件核心序列５′－ＧＧＡＡＣＡｎｎｎＴＧＴＡＴＣ－３′，通过与以睾酮或双氢睾酮为标准品所作的标准曲线作比对，确定待测样品中类雄激素物质相对于双氢睾酮的毒性当量。本发明专利技术试剂盒操作简便、灵敏、通量高，检测限可达ｐＭ级。可广泛用于食品、环境检测等领域。

A ELISA kit for detection of environmental androgen toxicity based on androgen receptor mediated principle

The present invention relates to a ELISA kit based on androgen receptor mediated principle for detecting environmental androgen toxicity. The kit comprises: a probe of androgen receptor protein binding buffer, a package is the standard anti enzyme polystyrene plate, enzyme mixture, substrate color solution, the termination solution, 10 x concentrated washing liquid, standard, quality control. The probe is a 5 'end with double stranded biotinylated DNA, the sequence containing at least one androgen response element core sequence 5' GGAACAnnnTGTATC 3 ', the standard curve made with testosterone or dihydrotestosterone as a standard for comparison, to determine the sample in male hormone substances with respect to toxicity the equivalent of dihydrotestosterone. The reagent kit of the invention has the advantages of simple and convenient operation, high sensitivity and high flux, and the detection limit is up to pM. Can be widely used in food, environmental testing and other fields.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及环境类雄激素检测领域，具体涉及一种基于雄激素受体介导原理的检测环境类雄激素毒性当量的ELISA试剂盒。
技术介绍
随着工业污染加剧，环境内分泌干扰物成为继工业革命带来的煤烟污染及汽车工业带来的光化学烟雾污染之后的第3代环境污染物，将对人类健康产生重要影响。环境类雄激素(environmental antiandrogen， EA)就是这样一类重要的环境内分泌干扰物质，他们可模拟体内天然的雄激素，与雄激素受体(androgen rec印tor， AR)竞争性结合，阻止体内雄激素与AR的结合，充当AR拮抗剂，从而抑制雄激素活性，发挥类雄激素作用，动物胚胎期暴露可导致生殖器官发育不全或缺失(特别是副睾)、外生殖器畸形(尿道下裂)、隐睾、肛门与生殖器距离縮短等生殖毒性和畸形。目前报道的EA主要涉及一些非甾体药物如氟他胺(flutamide， FLU)、非那雄胺(finasteride, FIN)，农药中的杀虫剂、杀菌剂和除草剂及其代谢产物，如合成除虫菊酯类(pyrethroids) 、 DDT的代谢产物p， p' -DDE、甲氧滴滴涕(methoxychlor)、杀菌禾U (procymidone)、烯菌酮(vinclozolin， V)及其代i射产物M丄禾口M2等。 因为环境类雄激素以痕量的形式存在于污水、土壤等环境中，其检测常常受到诸多限制，成为近年来研究热点之一。 传统的检测方法中多以GC和GC-MS法作为检测EA的标准方法。但由于EA通常以痕量混合物的形式存在，各种物质化学性质差异很大，且环境中存在着大量化学物，采用传统的萃取富集、高效液相色谱/质谱/气相色谱等方法分离出单一成分并测定含量，其分析手段复杂、操作繁琐、费时费力、设备昂贵、需要专门高级训练，并且很难达到所有痕量成分的完全解析；虽然免疫学技术检测灵敏度和通量较高，但仅能检测具备特异抗体的部分物质；而传统的受体结合试验因为需要放射性同位素标记而使其应用受到了很大的限制。所以必须探索快速、高通量、灵敏度高且重复性好的廉价筛选方法。 实际上，评估痕量混合物的综合生物学效应及累加毒性当量(TEQ)更有意义。目前基于受体配体结合的筛选方法，既可以反映EA的结合量，又能综合反映EA的类雄激素样累加毒性当量，且易于实现高通量，是最近几年EA高通量筛选和监测的新方向。Gaido等(GaidoK W， et al. Toxicol A卯l Pharmacol, 1997， 143 (1) :205-212)采用重组酵母测评体系评价环境类雄激素诱导的酵母细胞内结合效应，但此方法检出在P M nM水平，灵敏度和准确性尚不理想。 经典雄激素受体信号转导理论认为，内源性雄激素作为配体与雄激素受体结合后，受体发生二聚体化变构并暴露DNA结合区，使特异的DNA序列即雄激素效应元件(Androgen response elements, ARE)与之结合，剌激靶基因转录，表现出各种生理效应(Foradori C. D. ， et al. FrontNeuroendocrinol. 2008 ;29 (2) :169-181)。 ARE的核心序列3为5' -GGAACAnnnTGTATC-3' (n为任意核苷酸)。环境类雄激素，也即EA，主要以与内源 雄激素如双氢睾酮(DHT)类似的形式，通过AR介导而产生相应的病理性效应。基于此雄激 素受体介导原理可检测环境类雄激素的综合累加毒性当量。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种廉价、快速、高通量的基于雄激素受体介导原理的检测 环境类雄激素毒性当量的ELISA试剂盒。 本专利技术采用的技术方案是这样的，即一种基于雄激素受体介导原理的检测环境类雄激素毒性当量的ELISA试剂盒，其特征在于其组成包括探针，雄激素受体蛋白，结合缓冲液， 一抗包被的聚苯乙烯酶标板，酶混合液，底物显色液，终止液，10 X浓縮洗涤液，标准品，质控品；所述探针为5'端用生物素标记的双链DNA，该序列含有至少一个雄激素反应元件核心序列5 ' -GGAACAmnTGTATC-3 '，其中n为任意核苷酸，能特异结合配体_AR 二聚体；所述结合缓冲液每升由1. 2 12. 5g Tris-HCl，O. 1 1. 5g EDTA，7. 5 35g KC1，0. 1 2g二硫赤藓糖醇，1 5g牛血清白蛋白，50 100ml甘油及余量为去离子水组成；所述一抗包被的聚苯乙烯酶标板所包被的一抗为雄激素受体单克隆抗体；所述标准品为1X10—6mol/L的睾酮或双氢睾酮；质控品为5ng/ul的所述探针。 本专利技术的一个非限定性的实施例中，探针的核苷酸正链序列为SEQ Nol。 上述酶混合液为含有链亲和素标记的辣根过氧化物酶的PBS缓冲液。 10 X浓縮洗涤液每升由80gNaCl， 11. 5g Na2HP04 2H20， 2g KH2P04，2g KC1、5mlTween-20、0. 5g poly(dl:dC)及余量为去离子水组成的混合液。 底物显色液分为A、 B两种，分别含有过氧化氢和四甲基联苯胺TMB。 终止液为lmol/L的硫酸。 本试剂盒中重组人雄激素受体蛋白组分保存于-70 °C ，探针保存于-20 °C ，尽量减 少反复冻融，其余组分保存于4°C 。 本专利技术利用配体-受体生物学激活效应的高效、特异性，生物素-亲和素的放大效 应和辣根过氧化酶催化底物显色的灵敏性，以及ELISA操作的便捷性，构建了痕量环境类 雄激素(EA)累加毒性当量(TEQ)的快速ELISA检测试剂盒，实现痕量环境类雄激素TEQ的 廉价、快速、高通量监测。 本专利技术试剂盒使用方法包括以下步骤 (1)标准品用结合缓冲液稀释为1 X 10—6mol/L 1 X 10—12mol/L共7个梯度；雄激 素受体蛋白用结合缓冲液稀释为2X10—9mol/L ;10X浓縮洗涤液用去离子水稀释为IX洗 涤液； (2)受体配体体外结合总体积lOOul，其中含50ul标准品或含环境类雄激素的 待检样品，50ul稀释后的雄激素受体，于4t:振摇孵育1小时，然后37t:孵育30分钟，再加 入探针lul， 37t:反应10分钟，成生物素DNA探针-雄激素受体-环境类雄激素复合物；以 50ul不含样品或不含标准品的结合缓冲液作为本底对照；所有反应均做复孔； (3)ELISA反应将步骤(2)的复合物加入到一抗包被的聚苯乙烯酶标板中，室温 孵育1小时，弃上清，350ul洗涤液洗涤5次；加入50ul链亲和素标记的辣根过氧 物酶， 37t:孵育0. 5-1小时，弃上清，350ul洗涤液洗涤5次；加入显色液A和B各50ul， 37。C孵育15分钟，加入50ul终止液；同时做ELISA的质控品和试剂空白对照； (4)酶标仪检测在ELISA检测仪上，以试剂空白对照调零，以630nm波长做校正， 于450nm波长处，测定各孔吸光度值； (5)结果计算相对结合量=样本或标准品吸光度值_本底对照吸光度值，与以睾 酮或双氢睾酮为标准品所作的标准曲线作比对，确定待测样品中类雄激素物质相对于睾酮 或双氢睾酮的累计当量。 本专利技术试剂盒操作简便、快捷，技术平台要求不高，普通实验室即可开展；在1-2 天内能出具结果、试验周期极短；灵敏本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于介导原理的检测环境类雄激素毒性当量的ＥＬＩＳＡ试剂盒，其特征在于其组成包括：探针，雄激素受体蛋白，结合缓冲液，一抗包被的聚苯乙烯酶标板，酶混合液，底物显色液，终止液，１０×浓缩洗涤液，标准品，质控品；所述探针为５′端用生物素标记的双链ＤＮＡ，该序列含有至少一个雄激素反应元件核心序列５′－ＧＡＡＣＡｎｎｎＴＧＴＡＴＣ－３′，其中ｎ为任意核苷酸，能特异结合配体－雄激素受体二聚体；所述结合缓冲液每升由１．２～１２．５ｇＴｒｉｓ－ＨＣｌ，０．１～１．５ｇＥＤＴＡ，７．５～３５ｇＫＣｌ，０．１～２ｇ二硫赤藓糖醇，１～５ｇ牛血清白蛋白，５０～１００ｍｌ甘油及余量为去离子水组成；所述一抗包被的聚苯乙烯酶标板所包被的一抗为雄激素受体单克隆抗体；所述标准品为１×１０↑［－６］ｍｏｌ／Ｌ的睾酮或双氢睾酮；质控品为５ｎｇ／ｕｌ的所述探针。

【技术特征摘要】
一种基于介导原理的检测环境类雄激素毒性当量的ELISA试剂盒，其特征在于其组成包括探针，雄激素受体蛋白，结合缓冲液，一抗包被的聚苯乙烯酶标板，酶混合液，底物显色液，终止液，10×浓缩洗涤液，标准品，质控品；所述探针为5′端用生物素标记的双链DNA，该序列含有至少一个雄激素反应元件核心序列5′-GAACAnnnTGTATC-3′，其中n为任意核苷酸，能特异结合配体-雄激素受体二聚体；所述结合缓冲液每升由1.2～12.5g Tris-HCl，0.1～1.5g EDTA，7.5～35g KCl，0.1～2g二硫赤藓糖醇，1～5g牛血清白蛋白，50～100ml甘油及余量为去离子水组成；所述一抗包被的聚苯乙烯酶标板所包被的一抗为雄激素受体单克隆抗体；所述标准品为1×10-6mol/L的睾酮或双氢睾酮；质控品为5ng/ul的所述探针。2. 根据权利要求1所述的基于雄激素受体介导原理的检测环境类雄激素毒性当量的 ELISA试剂盒，其特征是探针的核苷酸正链序列为SEQ Nol或SEQ No3。3. 根据权利要求1所述的基于雄激素受体介导原理的检测环境类雄激素毒性当量的 ELISA试剂盒，其特征是所述酶混合液为含有链亲和素标记的辣根过氧化物酶的PBS缓冲 液。4. 根据权利要求1所述的基于雄激素受体介导原理的检测环境类雄激素毒性当量的 ELISA试剂盒，其特征是10X浓縮洗涤液每升由80gNaCl， 11. 5g Na^PC^ *2H20，2g KH2P04， 2g KCl、5ml Tween-20、0. 5g poly(dl:dC)及余量为去离子水组成的混合液。5. 根据权利要求1所述的基于雄激素受体介导原理的检测环境类雄激素毒性当量的 ELISA试剂盒，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭文婷，邓国宏，章容，毛青，王莎莎，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]