LIMK-1、其类似物和配体在制备抗血栓形成或血液凝固疾病的药物中的用途制造技术

本发明专利技术涉及ＬＩＭＫ－１、ＬＩＭＫ－１类似物或ＬＩＭＫ－１配体用于结合ＧＰⅡｂ和／或激活或抑制ＧＰⅡｂ／Ⅲａ下游信号传递（的用途），用于制备预防或治疗血栓形成或血液凝固疾病的药物（的用途），（涉及）筛选ＬＩＭＫ－１类似物或ＬＩＭＫ－１配体的方法以及制备治疗血栓形成或血液凝固疾病的药物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】LIMK-1、其类似物和配体在制备抗血栓形成或血液凝固疾病的药物中的用途
本专利技术涉及LIMK-1、LIMK-1类似物或LIMK-1配体用于结合GPIIb和/或激活或抑制GPIIb/IIIa下游信号传递(的用途)，用于制备预防或治疗血栓形成或血液凝固疾病的药物(的用途)，(涉及)筛选LIMK-1类似物或LIMK-1配体的方法以及制备治疗血栓形成或血液凝固疾病的药物的方法。技术背景血小板是最小的血细胞，虽然仅仅是巨核细胞胞浆的一部分，然而它们在正常止血中具有关键作用，并且是促成血栓形成性紊乱的重要因素。血小板粘附、激活和聚集是引发止血的首要必备反应，并在广泛的各种心血管疾病、脑血管疾病和外周血管疾病的病理学中起作用(Bhatt等，2003；George 2000；Moroi等，1998；Rao等，2000；Ruggeri 2002)。血小板膜含有高浓度的整联蛋白和其它糖蛋白，它们参与使血小板粘附至胞外基质成分(Lopez等，1988；Philips等，1988；Shattil 1999)。胶原纤维和冯·维勒布兰德因子(vWF)提供了重要的位点，使血小板粘附于暴露的内皮下，在血管损伤部位诱捕它们并使之形成单层细胞覆盖在损伤区域上(Ruggeri 2002；Watson 1999)。胶原纤维和vWF，和通过G-蛋白偶联受体(GPCRs)起作用的信号相呼应，也刺激血小板的激活，导致整联蛋白糖蛋白GPIIb/IIIa(也称之为□IIb□3)的“内-外”调节、从致密颗粒和α颗粒中的分泌、凝血噁烷的产生和促凝血活性的表达(Parise 1999；Ruggeri 2002；Shattil 1999)。同样，经激活血小板从正常的盘状变为带有长树枝状延伸的紧凑球形以便于粘附。所有这些事件支持了凝血过程。在-->结合了纤维蛋白原、冯·维勒布兰德因子(vWF)和纤连蛋白的血小板的表面，膜蛋白GPIIb(CD41)和GPIIIa(CD61)形成最丰富的异源二聚体复合物。GPIIb/IIIa以失活的构象表达在静息血小板的表面上，其对于可溶性纤维蛋白原具有低的亲和性。在血小板通过大量重要的激动剂如胶原、ADP或凝血酶激活之后，GPIIb/IIIa经历构象变化，提高了其结合可溶性纤维蛋白原的亲和性，导致血小板聚集(Parise 1999；Ruggeri 2002；Shattil 1999)。GPIIb/IIIa的信号传递涉及其胞浆尾部的数个区域。数种信号传递蛋白与GPIIb/GPIIIa整联蛋白的胞浆结构域结合，包括内联蛋白、钙和整联蛋白结合蛋白(CIB)、Shc和Grb2。此外，α亚基的胞浆尾部的序列KVGFFKR参与信号传递，且对应于该区域的脂质修饰的肽完全激活了血小板(Stephens等，1998)。然而，引导从血小板激活到纤维蛋白原受体暴露的一系列精确的信号传递事件是未知的。由于证实了阿斯匹林对于血小板和在心肌梗塞的主要预防中是有效的，阿斯匹林对于血栓形成性紊乱的预防性使用已经迅速增加。因而，几十年来，抗血小板治疗集中在凝血噁烷路径以及阿斯匹林对它的抑制方面。考虑到其相关性，预期粘附是开发抗血栓药物的一个吸引人的靶标。然而，设计用以防止血小板聚集的首个系列的化合物，即αIIbβ3拮抗剂，用于口服长期治疗并未成功。这被假定为是由于αIIbβ3拮抗剂(其中许多是基于纤维蛋白原中的受体识别序列)与天然的配体一样，实际上引起了‘外-内’信号传递的事实(Cox等，2000)。因而，直接干预配体和受体之间的相互作用而不激活血小板也许是不可能的。在最近几年间，已经介绍了一些抗血小板疗法，且有文献记录了包括从阿斯匹林到噻氯匹啶(ticlopidine)和氯吡格雷(clopidrogel)等的抗血小板治疗在血栓栓塞性紊乱中的益处(Konstantopoulos等，2001；Mousa等，2002；Weksler 2000)。然而，虽然所有这些不同的治疗对于治疗血栓栓塞性紊乱增加了另外的益处，但是仍然存在许多病例，即使用不同药剂联合治疗的效果也不是足够的。而且，在许多病例中，这些抗血小板疗法的治疗伴随着不期望的副作用。因而，迫切需要用于治疗血栓栓塞性紊乱的新-->方法。
技术实现思路
因此，本专利技术的一个目标是提供用于增强预防和治疗血栓形成或血液凝固疾病的新方法和鉴定例如抗血栓性治疗的新靶标的方法。令人惊讶的是，现在发现LIMK-1蛋白与GPIIb/IIIa结合。LIMK-1是72.6kDA的蛋白(人：647个氨基酸)，并且是含LIM基序的蛋白激酶家族的成员。其基因图谱位于染色体7，即7q11.23上。该蛋白质包含两个N-末端富含半胱氨酸的LIM/双锌指基序、一个具有数个推断的酪蛋白激酶和MAP激酶识别位点的富含脯氨酸丝氨酸的区域、一个PDZ结构域(PSD95/disc large/ZO-1)和一个C末端丝氨酸/苏氨酸激酶结构域。据假定锌指样LIM-结构域介导蛋白质-蛋白质相互作用，且在核与细胞骨架蛋白中已有描述。已经显示，LIMK-1的C-末端激酶片断与LIM结构域结合，且LIM片断剂量依赖性地抑制LIMK-1的激酶核心片断的激酶催化活性。因而，N-末端LIM结构域通过直接与C-末端激酶结构域相互作用而负调节LIMK-1的激酶活性(Nagata等，1999)。LIM结构域激酶1(LIMK-1)经由切丝蛋白(cofilin)的磷酸化作用调节肌动蛋白细胞骨架的重建。活性切丝蛋白引起肌动蛋白的解聚。通过LIMK-1的切丝蛋白磷酸化作用结果导致切丝蛋白肌动蛋白解聚活性的失活(Bierne等，2001；Gohla等，2002；Yang等，1998)。然而，迄今为止还没有关于LIMK-1(或LIMK-2)在血小板中的潜在作用的报道。由于LIMK-1与血小板整联蛋白GPIIb结合，LIMK-1触发了由血小板激活所诱发的并且是血小板激活所必要的血小板的形状变化。抑制LIMK-1从而导致经促血栓形成刺激的血小板激活的抑制。因此，LIMK-1抑制剂干扰血小板的激活和聚集从而干扰血栓形成。因此，本专利技术的第一个方面涉及在体外和在体内LIMK-1或LIMK-1类似物结合GPIIb的用途，特别是为了调节(优选抑制)整联蛋白GPIIb/IIIa下游的信号转导。-->根据本专利技术的LIMK-1是任何天然存在的LIMK-1蛋白。这包括不同物种的LIMK-1蛋白及其变体，优选脊椎动物，更优选哺乳动物，也可以是剪接变体。优选的LIMK-1蛋白是人LIMK-1蛋白。人LIMK-1蛋白的氨基酸序列公布在Mizuno等，《原癌基因》(Oncogene)9：1605-1612，1994中。根据本专利技术的术语“LIMK-1类似物”是指结合GPIIb的衍生自LIMK-1但不是LIMK-1的蛋白质。更特别地，是指与天然存在的LIMK-1序列(即野生型多肽)有一个或多个氨基酸不同的氨基酸序列。这样的类似物以取代、插入或缺失一个或多个氨基酸而不同于野生型多肽。优选的是半保守的(氨基酸取代)，更优选的是保守氨基酸的取代，由此一个残基被具有相似特征的另一个残基所取代。典型的取代发生在脂肪族氨基酸之间，在具有脂肪族羟基侧链的氨基酸之间，在具有酸性残基的氨基酸之间，在酰胺本文档来自技高网...

【技术保护点】
ＬＩＭＫ－１或ＬＩＭＫ－１类似物用于结合ＧＰⅡｂ的用途。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】EP 2003-12-4 03027839.41.LIMK-1或LIMK-1类似物用于结合GPIIb的用途。2.根据权利要求1的用途，其中LIMK-1类似物是GPIIb/IIIa下游信号传递的激活剂或抑制剂，优选为其抑制剂。3.根据权利要求1或2的用途，用于GPIIb/IIIa下游信号传递的激活或抑制，优选用于其抑制。4.LIMK-1配体用于激活或抑制GPIIb/IIIa下游信号传递的用途，优选用于其抑制。5.根据权利要求4的用途，其中LIMK-1配体是一种LIMK-1激动剂或LIMK-1拮抗剂，优选为LIMK-1拮抗剂。6.LIMK-1、LIMK-1类似物或LIMK-1配体在制备用于预防或治疗血栓形成或血液凝固疾病的药物中的用途。7.根据权利要求6的用途，其中LIMK-1类似物是GPIIb/IIIa下游信号传递的抑制剂，或者其中LIMK-1配体是LIMK-1拮抗剂。8.根据权利要求6或7的用途，其中所述疾病是与血栓形成或血液凝固增加相关的疾病。9.根据权利要求6至8任一项的用途，其中所述疾病是动脉血栓形成性疾病。10.根据权利要求6至9任一项的用途，其中所述疾病选自心肌梗塞、不稳定型心绞痛、急性冠状动脉综合症、冠状动脉疾病、冠状动脉溶栓后再闭塞、血栓形成期间的闭塞和冠状动脉再狭窄、中风、短暂性脑缺血发作、肺栓塞、左心室功能障碍、患有心血管和脑血管疾病的患者的临床血管并发症的二级预防、动脉粥样硬化、血管介入性策略的结合药物治疗。11.一种筛选LIMK-1类似物的方法，其中该方法包括步骤：(a)提供GPIIb蛋白和任选地至少一个其下游信号传递元件；(b)提供测试化合物；和(c)检测测试化合物对GPIIb蛋白的结合，其中所述测试化合物衍生-->自LIMK-1。12.根据权利要求11的方法，包括如下步骤以替换步骤(c)：(c’)检测GPIIb/IIIa和/或其下游信号传递的激活或抑制。13.一种筛选LIMK-1配体的方法，其中该方法包括步骤：(a)提供LIMK-1蛋白；(b)提供测试化合物；和(c)检测测试化合物对LIMK-1蛋白的结合。14.根据权利要求13的方法，还包括如下步骤以替换步骤(c)：(c’)检测LIMK-1或GPII/IIIa下游...

【专利技术属性】
技术研发人员：A吕克，T莱乌，M赫尔曼，G西本霍恩，
申请(专利权)人：塞诺菲安万特德国有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]