【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术的领域大体涉及化学诱导的肝祖细胞、用其制备和由其制备的组合物以及使用其治疗肝纤维化的方法。
技术介绍
1、肝细胞被认为是细胞移植治疗肝脏疾病的唯一有效细胞来源；然而，由于供体短缺，肝细胞的可用性有限。因此，必须开发改进的细胞来源和替代治疗方法。结果表明，使用小分子抑制剂的适当组合，可以从成熟的啮齿动物肝细胞和人类婴儿肝细胞中获得具有再生(repopulative)能力的肝祖细胞(katsuda等人,cell stem cell 20,41-55,(2017),dx.doi.org/10.1016/j.stem.2016.10.007,katsuda等人,elife 8:e47313,31页,(2019)doi.org/10.7554/elife.47313)。然而，这些细胞改善肝功能的能力的潜在机制及其治疗肝脏疾病和病症的用途范围尚不清楚。
2、因此，本专利技术的目的是深入了解化学诱导的肝祖细胞改善肝功能的能力的机制，以及基于此开发的改进的组合物及其使用方法。
技术实现思路
1、提供了组合物、制备组合物的方法和使用组合物治疗肝脏疾病、病症和损伤的方法。所述组合物包括化学诱导的肝祖细胞(clip)和/或由clip形成的无细胞材料，例如细胞外囊泡(ev)，例如外泌体。在一些实施方案中，所述组合物和/或方法在需要的受试者中有效地减少现有的肝胶原或新的肝胶原的形成；减少现有纤维化的量或新纤维化的形成；诱导一种或多种肝纤维化相关基因表达的变化，任选地mmp2 mrna的
2、还提供了制备由clip形成的ev的方法。所述方法通常包括培养clip和收获由clip分泌的ev。通常，用tgfβ信号传导抑制剂如a83-01培养细胞，例如浓度为约1μm至约10μm，或约0.1μm至10μm，或约0.5μm。通常，细胞也与gsk3抑制剂如chir99021一起培养，例如浓度为约0.1μm至约20μm，约1μm至约10μm，或约3μm。
3、通常，细胞开始于从哺乳动物肝脏分离/纯化的肝细胞。
4、在一些实施方案中，特别是在起始细胞为人肝细胞的那些实施方案中，将细胞与血清如胎牛血清(fbs)一起培养，例如以培养基的5-20％或培养基的约10％的浓度培养。
5、在一些实施方案中，特别是在起始细胞为啮齿类动物细胞(例如来自小鼠或大鼠的细胞)的那些实施方案中，用rock抑制剂(例如y-27632)培养细胞，例如浓度为约1μm至约100μm，或约5μm至约25μm，或约10μm。在一些实施方案中，特别是在其中细胞是来自人的那些实施方案中，rock抑制剂可以从培养中排除。
6、细胞可以与一种或多种抑制剂和/或血清一起培养至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天；或约5天至约25天，或其间的任何子范围或整数的天数，任选地约7天至约22天，约5天至约25天，或约10天至约20天，或约12天至约17天；或约13、14或15天。
7、还提供了包括有效量的clip和/或由其形成的ev的药物组合物。
8、所述组合物可用于治疗有需要的受试者的治疗性和非治疗性方法，所述方法通常包括向受试者施用药物组合物，所述药物组合物包括有效量的clip和/或由其形成的ev。在一些实施方案中，所述方法对于治疗受试者的肝纤维化是有效的。
9、在一些实施方案中，所述组合物包括ev或分泌ev的clip，所述ev具有一种或多种微小rna(例如hsa-mir-103a-3p,hsa-mir-hsa-mir-122-5p,hsa-mir-125a-5p,hsa-mir-125b-5p,hsa-mir-126-3p,hsa-mir-1324,hsa-mir-142-3p,hsa-mir-151a-3p,hsa-mir-155-5p,hsa-mir-16-5p,hsa-mir-182-5p,hsa-mir-183-5p,hsa-mir-191-5p,hsa-mir-192-5p,hsa-mir-21-5p,hsa-mir-221-3p,hsa-mir-224-5p,hsa-mir-23a-3p,hsa-mir-24-3p,hsa-mir-24-3p,hsa-mir-26a-3p,hsa-mir-28-3p,hsa-mir-29a-3p,hsa-mir-29b-3p,hsa-mir-30a-5p,hsa-mir-30d-5p,hsa-mir-30e-5p,hsa-mir-31-5p,hsa-mir-34a-5p,hsa-mir-3663-3p,hsa-mir-4435,hsa-mir-4440,hsa-mir-5096,hsa-mir-510-3p,hsa-mir-92a-3p,hsa-mir-93-5p和hsa-mir-99b-5p中的一种或多种)和/或一种或多种细胞因子任选地其中所述一种或多种细胞因子是或包括tnfα或其任意组合。
10、在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用第二活性剂。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用tnfα。
11、所述方法可用于治疗患有肝脏疾病或病症的受试者，例如感染，任选地甲型、乙型或丙型肝炎；免疫系统问题，任选地自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎或原发性硬化性胆管炎；癌症，任选地肝癌、胆管癌或肝细胞腺瘤；遗传性肝脏病症，任选地血色素沉着症、高草酸尿症、威尔逊病或α-1抗胰蛋白酶缺乏症；酗酒和/或药物过量造成的损害；或非酒精性脂肪性肝病。
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1.制备细胞外囊泡(EV)的方法，其包括培养化学诱导的肝祖细胞(CLiP)并收获由CLiP分泌的EV。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述CLiP通过包括用TGFβ信号传导的抑制剂培养肝细胞的方法形成。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述TGFβ信号传导的抑制剂为A83-01。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述A83-01的浓度为约1μM至约10μM，或约0.1μM至约10μM，或约0.5μM。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述CLiP通过包括用GSK3抑制剂培养肝细胞的方法形成。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述GSK3抑制剂为CHIR99021。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述CHIR99021的浓度为约0.1μM至约20μM，约1μM至约10μM，或约3μM。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述CLiP通过包括用血清培养肝细胞的方法形成。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述血清为胎牛血清(FBS)。
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11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述CLiP通过包括用ROCK抑制剂培养肝细胞的方法形成。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述ROCK抑制剂为Y-27632。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述Y-27632的浓度为约1μM至约100μM，或约5μM至约25μM，或约10μM。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述细胞开始于从哺乳动物肝脏分离/纯化的肝细胞。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述细胞与一种或多种所述抑制剂和/或血清一起培养至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天；或约5天至约25天，或其间的任何子范围或整数天数，任选地约7天至约22天，约5天至约25天，或约10天至约20天，或约12天至约17天；或约13、14或15天。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述EV包含外泌体或由外泌体组成。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述细胞是人细胞，并且所述培养包含TGBβ抑制剂、GSK3抑制剂和血清，并且任选地不包括ROCK抑制剂。
18.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述细胞是小鼠或大鼠细胞，并且所述培养包含TGBβ抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂，并且任选地不包括血清。
19.细胞外囊泡(EV)，其根据权利要求1-18中任一项所述的方法制备。
20.药物组合物，其包含有效量的根据权利要求19所述的EV。
21.治疗受试者的治疗性或非治疗性方法，其包括向受试者施用根据权利要求20所述的药物组合物。
22.治疗受试者的肝纤维化的方法，其包括向受试者施用包含有效量的CLiP的药物组合物或根据权利要求20所述的药物组合物。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述CLiP由人细胞形成。
24.根据权利要求22-23中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含CLiP。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述CLiP分泌EV，所述EV包含hsa-miR-103a-3p,hsa-miR-122-5p,hsa-miR-125a-5p,hsa-miR-125b-5p,hsa-miR-126-3p,hsa-miR-1324,hsa-miR-142-3p,hsa-miR-151a-3p,hsa-miR-155-5p,hsa-miR-16-5p,hsa-miR-182-5p,hsa-miR-183-5p,hsa-miR-191-5p,hsa-miR-192-5p,hsa-miR-21-5p,hsa-miR-221-3p,hsa-miR-224-5p,hsa-miR-23a-3p,hsa-miR-24-3p,hsa-miR-24-3p,hsa-miR-26a-3p,hsa-miR-28-3p,hsa-miR-29a-3p,hsa-miR-29b-3p,hsa-miR-30a-5p,hsa-miR-30d-5p,hsa-miR-30e-5p,hsa-miR-31-5p,hsa-miR-34a-5p,hsa-miR-3663-3p,hsa-miR-4435,hsa-miR-4440,hsa-miR-5096,hsa...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.制备细胞外囊泡(ev)的方法，其包括培养化学诱导的肝祖细胞(clip)并收获由clip分泌的ev。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述clip通过包括用tgfβ信号传导的抑制剂培养肝细胞的方法形成。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述tgfβ信号传导的抑制剂为a83-01。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述a83-01的浓度为约1μm至约10μm，或约0.1μm至约10μm，或约0.5μm。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述clip通过包括用gsk3抑制剂培养肝细胞的方法形成。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述gsk3抑制剂为chir99021。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述chir99021的浓度为约0.1μm至约20μm，约1μm至约10μm，或约3μm。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述clip通过包括用血清培养肝细胞的方法形成。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述血清为胎牛血清(fbs)。
10.根据权利要求8和9所述的方法，其中所述血清为培养基的约5-20％，或培养基的约10％。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述clip通过包括用rock抑制剂培养肝细胞的方法形成。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述rock抑制剂为y-27632。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述y-27632的浓度为约1μm至约100μm，或约5μm至约25μm，或约10μm。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述细胞开始于从哺乳动物肝脏分离/纯化的肝细胞。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述细胞与一种或多种所述抑制剂和/或血清一起培养至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天；或约5天至约25天，或其间的任何子范围或整数天数，任选地约7天至约22天，约5天至约25天，或约10天至约20天，或约12天至约17天；或约13、14或15天。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述ev包含外泌体或由外泌体组成。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述细胞是人细胞，并且所述培养包含tgbβ抑制剂、gsk3抑制剂和血清，并且任选地不包括rock抑制剂。
18.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述细胞是小鼠或大鼠细胞，并且所述培养包含tgbβ抑制剂、gsk3抑制剂和rock抑制剂，并且任选地不包括血清。
19.细胞外囊泡(ev)，其根据权利要求1-18中任一项所述的方法制备。
20.药物组合物，其包含有效量的根据权利要求19所述的ev。
21.治疗受试者的治疗性或非治疗性方法，其包括向受试者施用根据权利要求20所述的药物组合物。
22.治疗受试者的肝纤维化的方法，其包括向受试者施用包含有效量的clip的药物组合物或根据权利要求20所述的药物组合物。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述clip由人细胞形成。
24.根据权利要求22-23中任一项所述的方法，其中所述药物组合物包含clip。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述clip分泌ev，所述ev包含hsa-mir-103a-3p,hsa-mir-122-5p,hsa-mir-125a-5p,hsa-mir-125b-5p,hsa-mir-126-3p,hsa-mir-1324,hsa-mir-142-3p,hsa-mir-151a-3p,hsa-mir-155-5p,hsa-mir-16-5p,hsa-mir-182-5p,hsa-mir-183-5p,hsa-mir-191-5p,hsa-mir-192-5p,hsa-mir-21-5p,hsa-mir-221-3p,hsa-mir-2...
【专利技术属性】
技术研发人员：落谷孝广，
申请(专利权)人：埃维亚生命科学有限公司，
类型：发明
国别省市：
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